基于TIRF显微镜的吞噬体形成与闭合过程可视化

摘要

来源：Marie-Anaïs, F.，等。“吞噬体闭合检测”：利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在三维水平可视化吞噬体形成过程。 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种高分辨率的全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，用于实时观察巨噬细胞介导的吞噬作用过程中，当IgG包被的红细胞（RBCs）附着在玻璃底培养皿表面时，吞噬体的形成及闭合过程。巨噬细胞会向红细胞周围延伸伪足，将其包裹进吞噬体内，并使其从玻璃表面脱离。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：实验所用 Lifeact-mCherry 质粒由巴黎居里研究所 Guillaume Montagnac 博士惠赠。

1. 细胞与转染

注意：RAW264.7 巨噬细胞在 100 mm 培养皿中，使用完全培养基（RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10% FCS（胎牛血清））培养至亚汇合状态。通过电穿孔法将编码荧光标记蛋白的质粒转染至细胞中。通常每次转染或共转染分别使用约 5 - 6 × 10⁶ 个细胞，并加入 20 µg 或 10 µg 质粒。请注意，基于电穿孔或脂质体转染的其他转染方法也可作为替代方案使用。

1. 用细胞刮将细胞刮下，并通过反复吹打数次，将细胞重悬于10 ml培养基中。
2. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，使用水平转子。
3. 将 10 ml 添加了 10 µg/ml 庆大霉素的完全培养基在 37 °C 预热。
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结果

图1. 通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）分析的“吞噬体闭合检测”示意图。 吞噬体闭合检测使用瞬时表达一种或两种荧光标记蛋白的巨噬细胞进行。将巨噬细胞接种于经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，该盖玻片上固定有经IgG调理的SRBCs（绵羊红血球）。通过TIRF模式采集图像以检测吞噬体闭合位点，同时通过落射荧光模式采集图像以检测吞噬杯底部。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗绵羊红细胞 IgG	MP Biomedicals	55806
牛血清白蛋白热激组分，pH 7，≥98%	Sigma	A7906
细胞刮	Corning	3008
4 mm 比色皿	Cell project	EP104
不含钙、镁的 DPBS	Thermo Fischer Scientific	14190-094	室温保存
电穿孔缓冲液试剂盒	Cell project	EB110
100 mm 细胞培养处理培养皿	Corning	353003
Gene X-cell 电穿孔仪	Biorad	165-2661
庆大霉素溶液	Sigma	G1397
35 mm 未包被玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C Case
iMIC	TILL Photonics		油镜（N 100x，NA 1.49）、带 CO2 的加热培养室、单光子检测 EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）相机及 1.5X 镜头
0.1% 多聚赖氨酸溶液	Sigma	P8920-100ml	用水稀释至 0.01%
含 GLUTAMAX 补充剂的 RPMI 1640 培养基	Life technologies	61870-010
不含酚红的 RPMI 1640 培养基（10×500 ml）	Life technologies	11835-105	使用前于 37°C 水浴中预热
绵羊红细胞（SRBCs）	Eurobio	DSGMTN00-0Q	使用前以 Alsever 缓冲液于 4°C 保存