基于TIRF显微镜的吞噬体形成与闭合过程可视化

摘要

来源：Marie-Anaïs, F.，等。“吞噬体闭合检测”：利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在三维水平可视化吞噬体形成过程。 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种高分辨率的全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，用于实时观察巨噬细胞介导的吞噬作用过程中，当IgG包被的红细胞（RBCs）附着在玻璃底培养皿表面时，吞噬体的形成及闭合过程。巨噬细胞会向红细胞周围延伸伪足，将其包裹进吞噬体内，并使其从玻璃表面脱离。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：实验所用 Lifeact-mCherry 质粒由巴黎居里研究所 Guillaume Montagnac 博士惠赠。

1. 细胞与转染

注意：RAW264.7 巨噬细胞在 100 mm 培养皿中，使用完全培养基（RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10% FCS（胎牛血清））培养至亚汇合状态。通过电穿孔法将编码荧光标记蛋白的质粒转染至细胞中。通常每次转染或共转染分别使用约 5 - 6 × 10⁶ 个细胞，并加入 20 µg 或 10 µg 质粒。请注意，基于电穿孔或脂质体转染的其他转染方法也可作为替代方案使用。

1. 用细胞刮将细胞刮下，并通过反复吹打数次，将细胞重悬于10 ml培养基中。
2. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，使用水平转子。
3. 将 10 ml 添加了 10 µg/ml 庆大霉素的完全培养基在 37 °C 预热。
4. 离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于3 ml电穿孔试剂盒中的“洗涤缓冲液A”中。
5. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，使用水平转子。
6. 同时在室温下配制DNA混合液：120 µl 2x Buffer B，20 µg 编码目标蛋白的质粒DNA， q.s.p. 240 µl H₂O.
7. 离心后，弃去全部上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于DNA混合物中，并转移至4 mm电穿孔比色皿中。
9. 室温孵育 3 分钟。
10. 电穿孔条件：250 V，900 µF。
11. 立即用预热（37 °C）的含庆大霉素的完全培养基重悬细胞，并接种至100 mm培养皿中。
12. 将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜₂.
13. 次日早晨，将完全培养基更换为10 ml无血清显微镜观察培养基（RPMI 1640，不含酚红，含10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺）。

2. 红细胞的调理作用

注意：绵羊红细胞（SRBCs）被用作巨噬细胞的颗粒靶标模型。通常，每个35 mm玻璃底培养皿中使用约7 x 10⁶个SRBCs。

1. 用 100 µl 的 1x PBS（磷酸盐缓冲液）/0.1% BSA（牛血清白蛋白）洗涤 SRBCs，然后离心（600 × g，4 分钟）。
2. 离心后，弃去上清液，将 SRBCs 重悬于 100 µl 的 1x PBS/0.1% BSA 中，再次离心（600 × g，4 分钟）。
3. 离心后，弃去上清液，将 SRBCs 重悬于含亚凝集浓度兔 IgG 抗 SRBCs 的 1x PBS/0.1% BSA 溶液中。每 5 µl SRBCs 使用含抗体的溶液 500 µl。
   注意：抗体的亚凝集浓度是指未引起凝集（即未形成网状结构）的最低浓度。通常，亚凝集浓度为 8.2 µg/ml。
   1. 通过血凝试验确定用于包被 SRBCs 的 IgG 抗 SRBCs 所需浓度。将 IgG 抗 SRBCs（储存浓度为 13.1 mg/ml）在微孔板中进行系列稀释，稀释倍数范围为 1/50 至 1/25,600。每孔加入 2 × 10⁶ 个 SRBCs。将微孔板避光置于室温孵育数小时。
4. 室温下缓慢旋转孵育 30 分钟。
5. 按照上述方法用 1x PBS/0.1% BSA 洗涤两次后，将 IgG 包被的 SRBCs（IgG-SRBCs）重悬于预热的无血清显微镜成像培养基中（每皿 2 ml）。

3. 盖玻片的多聚赖氨酸包被

1. 同时，在室温下用 2 ml 的 0.01% 多聚-L-赖氨酸处理 35 mm 玻璃底培养皿 30 分钟。
2. 用 2 ml 的 1× PBS 将培养皿洗涤两次。

4. 玻璃底培养皿上SRBCs的非共价固定

1. 每35 mm玻璃底培养皿中加入2 ml SRBCs悬浮液。
2. 使用摆动转子在500 × g条件下离心2分钟，使细胞沉降到35 mm玻璃底培养皿上。
3. 吸除上清液，并用2 ml 1× PBS/10% BSA洗涤一次。
4. 每培养皿中加入2 ml 1× PBS/10% BSA，孵育颗粒30分钟。
5. 用2 ml 1× PBS洗涤培养皿三次。
6. 将1× PBS替换为2 ml预热（37 °C）的无血清显微镜成像培养基。

5. 通过全内反射荧光显微镜观察吞噬作用

1. 显微镜
   注意： 本实验采用配备油浸物镜（N 100X，NA1.49）、含CO₂的加热培养室以及两个单光子探测相机EMCCD（电子倍增电荷耦合器件），并耦合1.5倍镜头的显微镜进行全内反射荧光显微镜（TIRFM）实验。
   1. 在进行TIRF显微镜实验的前一天，将加热培养室预热至37 ºC，以确保显微镜载物台均匀受热。
2. 临界角的确定
   注意： 使用ImageJ Color Profiler软件处理TIRF图像序列。
   1. 将含有经调理的SRBC及无血清显微镜成像培养基的35 mm玻璃底培养皿置于显微镜下。
   2. 刮取细胞并重悬于培养基中，随后加入培养皿（100 - 500 µl）。
   3. 使用“Live Acquisition”软件控制显微镜，采用491 nm和/或561 nm激光激发，以识别表达荧光标记蛋白的细胞。
   4. 选择一个表达荧光标记蛋白的细胞。
   5. 将其置于视野中央，并以单一激发波长采集500幅图像，入射角从0º开始，以0.01º为增量逐步增加至5º（图1A）。显微镜系统将自动调节角度。
   6. 确定使入射光在玻璃/培养基界面发生全反射并产生倏逝波的临界角。使用ImageJ Color Profiler软件，点击“File”、“Open”并选择文件，打开图像序列。
   7. 使用矩形工具在荧光均匀的细胞区域选择一个感兴趣区域（ROI）（图1B 黄色1）。
   8. 点击“Image”选项卡，下拉菜单中选择“Stacks”，再点击“Plot Z-axis Profile”，绘制ROI内平均荧光强度随x轴角度变化的“Z轴剖面图”（图1B 红色2）。
      注意：临界角是指荧光强度达到最大值后出现急剧下降前对应的角度。
   9. 在显微镜实验过程中，选择x轴上大于临界角的任意角度值（例如2.00）以获得TIRF信号（图1C）。
3. 图像采集
   1. 使用Live Acquisition软件，通过“Protocol Editor”模块设置采集参数（图2A）。
      1. 创建一个包含“Multi Channels”采集的“loop”协议，用于在TIRF区域采集目标蛋白的荧光信号。输入TIRF角度（例如2.00）、曝光时间（例如50 msec）和激光强度（例如50%）（图2B 1）。
      2. 设置物镜在TIRF区域上方3 µm处进行“Z move”，利用“Multi Channels”工具在落射荧光模式下采集信号。输入低于临界角的角度（例如1.00）、曝光时间（50 msec）和激光强度（50%）（图2B，2和3）。
      3. 接着添加物镜向下移动3 µm的“z move”，以返回TIRF区域（图2B 4）。添加一个明场LED（发光二极管）下的细胞“snapshot”图像（图2B 5）。
   2. 寻找一个表达中等水平荧光标记蛋白、并开始通过细胞膜延伸包裹颗粒以启动对SRBC吞噬作用的细胞。
   3. 将其置于视野中央。
   4. 开始采集500 - 1,000帧的连续图像。在“loop count”选项卡中输入“750帧”（图2B 1）。
      注意： 使用ImageJ Color Profiler软件处理TIRF图像序列。
   5. 在ImageJ软件中点击“File”、“Open”并选择文件，打开图像序列。
   6. 点击“Image”选项卡，下拉菜单中选择“Hyperstacks”，再点击“Stack to hyperstack”功能，将通道分离。在弹出的窗口中填写以下参数：顺序：xyctz；通道（c）：通道数量（例如“2”表示有两个荧光染料）；切片（z）：z轴切片数（例如“1”表示z轴无移动）；帧（t）：总图像数除以通道数；显示模式：灰度。
      注意： 将生成两个独立的图像序列，分别对应两个不同的通道。

结果

图1. 通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）分析的“吞噬体闭合检测”示意图。 吞噬体闭合检测使用瞬时表达一种或两种荧光标记蛋白的巨噬细胞进行。将巨噬细胞接种于经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，该盖玻片上固定有经IgG调理的SRBCs（绵羊红血球）。通过TIRF模式采集图像以检测吞噬体闭合位点，同时通过落射荧光模式采集图像以检测吞噬杯底部。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗绵羊红细胞 IgG	MP Biomedicals	55806
牛血清白蛋白热激组分，pH 7，≥98%	Sigma	A7906
细胞刮	Corning	3008
4 mm 比色皿	Cell project	EP104
不含钙、镁的 DPBS	Thermo Fischer Scientific	14190-094	室温保存
电穿孔缓冲液试剂盒	Cell project	EB110
100 mm 细胞培养处理培养皿	Corning	353003
Gene X-cell 电穿孔仪	Biorad	165-2661
庆大霉素溶液	Sigma	G1397
35 mm 未包被玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C Case
iMIC	TILL Photonics		油镜（N 100x，NA 1.49）、带 CO2 的加热培养室、单光子检测 EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）相机及 1.5X 镜头
0.1% 多聚赖氨酸溶液	Sigma	P8920-100ml	用水稀释至 0.01%
含 GLUTAMAX 补充剂的 RPMI 1640 培养基	Life technologies	61870-010
不含酚红的 RPMI 1640 培养基（10×500 ml）	Life technologies	11835-105	使用前于 37°C 水浴中预热
绵羊红细胞（SRBCs）	Eurobio	DSGMTN00-0Q	使用前以 Alsever 缓冲液于 4°C 保存