基于 TIRF 显微镜的吞噬体形成和闭合可视化

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

>注:使用的质粒 Lifeact-mCherry 是巴黎居里研究所纪尧姆·蒙塔尼亚克博士的一份礼物。

1. 细胞和转染

注:RAW264.7巨噬细胞在100 mm板中的完全培养基（RPMI（罗斯威尔公园纪念研究所）1640培养基，10 mM HEPES，1 mM丙酮酸钠，50μM β-巯基乙醇，2 mM L-谷氨酰胺和10%FCS（胎牛血清））中生长至亚汇合。通过电穿孔转染编码荧光标记蛋白的质粒。通常，每次转染或共转染分别用 20 μg 或 10 μg 质粒转染大约 5 - 6 x 10⁶ 个细胞。请注意，其他基于电穿孔或脂质转染的转染方法可用作替代方法。

1. 用细胞提升器刮擦细胞，并通过上下吹打数次将其重悬于 10 ml 培养基中。
2. 将细胞悬液离心 300 x g ，在 RT 下在摆动角转子中离心 5 分钟。
3. 在37°C下预热10 ml补充有10 μg/ ml庆大霉素的完全培养基。
4. 离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于电穿孔试剂盒中的 3 ml "洗涤缓冲液 A"中。
5. 将细胞悬液在室温下在摆动角转子中离心 300 x g 5 分钟。
6. 同时在室温下制备 DNA 混合物:120 μl 2x 缓冲液 B，20 μg 编码目标蛋白质的质粒 DNA，q.s.p. 240 μl H₂O。
7. 离心后，弃去整个上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于 DNA 混合物中，并转移到 4 mm 电穿孔比色皿中。
9. 在 RT 下孵育 3 分钟。
10. 在 250 V、900 μF 下进行电穿孔。
11. 立即将细胞重悬于补充有庆大霉素的预热 （37 °C） 完全培养基中，并将它们接种在 100 mm 培养皿中。
12. 将转染的细胞在 37 °C、5% CO₂ 下孵育过夜。
13. 第二天早上，用 10 ml 无血清显微镜培养基（不含酚红的 RPMI 1640、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、50 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺）替换完全培养基。

2. 红细胞的调理作用

注:作为巨噬细胞的颗粒目标模型，使用绵羊红细胞 （SRBC）。通常，每 35 mm 玻璃底培养皿使用大约 7 x 10⁶ 个 SRBC。

1. 用 100 μl 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）/0.1% BSA（牛血清白蛋白）洗涤 SRBC 并离心（600 x g，4 分钟）。
2. 离心后，弃去上清液，将 SRBC 重悬于 100 μl 1x PBS/0.1% BSA 中并离心（600 x g，4 分钟）。
3. 离心后，弃去上清液，将 SRBC 重悬于 1x PBS/0.1% BSA 中，含亚凝集浓度的兔 IgG 抗 SRBC。使用 500 μl 含有抗体的溶液/5 μl SRBC。
   注意: 抗体的亚凝集浓度对应于未诱导凝集的最低浓度，该浓度检测为网络形成。通常，亚凝集浓度为 8.2 μg/ml。
   1. 通过血凝试验确定调理 SRBC 所需的 IgG 抗 SRBC 浓度。在微孔板中连续稀释 IgG 抗 SRBC（原液为 13.1 mg/ml），浓度为 1/50 - 1/25,600。在每个孔中加入 2 x 10⁶ 个 SRBC。将板在 RT 下避光孵育数小时。
4. 在 RT 孵育 30 分钟，缓慢旋转。
5. 如上所述在 1x PBS/0.1% BSA 中洗涤两次后，将 IgG 调理素的 SRBC （IgG-SRBC） 重悬于预热的无血清显微镜培养基（2 ml/皿）中。

3. 盖玻片的聚赖氨酸涂层

1. 同时，在室温下用 2 ml 0.01% 聚-L-赖氨酸处理 35 mm 玻璃底培养皿 30 分钟。
2. 用 2 ml 1x PBS 清洗盘子两次。

4. SRBC 在玻璃底培养皿上的非共价固定

1. 每 35 毫米玻璃底培养皿倒入 2 ml SRBC 悬浮液。
2. 用摆动转子在 35 mm 玻璃底培养皿上以 500 x g 的速度离心 2 分钟。
3. 去除上清液，用 2 ml 1x PBS/10% BSA 洗涤一次。
4. 将颗粒与每皿 2 ml 1x PBS/10% BSA 孵育 30 分钟。
5. 用 2 ml 1x PBS 洗碗 3 次。
6. 用 2 ml 预热 （37 °C） 无血清显微镜培养基替换 1x PBS。

5. TIRFM 可视化的吞噬作用

1. 显微镜
   注意:使用配备油浸物镜 （N 100X， NA1.49）、带 CO₂ 的加热室和两个单光子检测相机 EMCCD （电子倍增电荷耦合器件） 耦合 1.5X 镜头的显微镜进行 TIRFM。
   1. 在 TIRF 显微镜会议的前一天，在 37 ºC 下打开加热室，以允许显微镜载物台均匀加热。
2. 临界角测定
   注意:ImageJ Color Profiler 软件用于处理 TIRF 图像流。
   1. 将含有调理素 SRBC 和无血清显微镜培养基的 35 mm 玻璃底培养皿置于显微镜下。
   2. 刮擦细胞并将其重悬于培养基中，然后将它们 （100 - 500 μl） 添加到培养皿中。
   3. 使用"实时采集"软件控制显微镜，并使用 491 nm 和/或 561 nm 激光进行激发，以识别表达荧光标记蛋白的细胞。
   4. 鉴定表达荧光标记蛋白的细胞。
   5. 将其放在场的中间，以一个激发波长采集 500 张图像，不同的角度从 0º 到 5º，增量为 0.01º（图 1A）。显微镜系统会自动改变角度。
   6. 确定允许入射光在玻璃/介质界面处完全反射并产生消逝波的临界角。使用 ImageJ Color Profiler 软件，通过单击"文件"、"打开"打开图像序列并选择文件。
   7. 使用矩形工具在具有均匀荧光的细胞中选择一个感兴趣区域 （ROI）（图 1B 黄色 1）。
   8. 通过单击"图像"选项卡、下拉菜单中的"堆栈"和"绘制 Z 轴轮廓"（图 1B 红色 2）<br />，绘制在 ROI 中测量的"Z 轴轮廓"平均荧光强度以及 x 轴上角度的函数。 注意:临界角是荧光急剧下降之前导致最大荧光的角度。
   9. 在显微镜检查期间，使用 x 轴上高于临界角的任何角度值来获得 TIRF 信号，例如 2.00（图 1C）。
3. 收购
   1. 使用 Live Acquisition 软件，使用模块"Protocol Editor"（图 2A）设置采集参数。
      1. 创建一个包含"多通道"采集的"环"方案，以从 TIRF 区域中的目标蛋白质中获取荧光信号。输入 TIRF 角度（例如 2.00）、曝光时间（例如 50 毫秒）和激光强度（例如 50%）（图 2B 1）。
      2. 在 TIRF 区域上方 3 μm 处引入物镜的"Z 移动"，以使用 "Multi Channels" 工具获得落射荧光信号采集。输入低于临界角（例如 1.00）、曝光时间（50 毫秒）和激光强度 （50%） 的角度（图 2B、2 和 3）。
      3. 接下来，在下面添加物镜 3 μm 的"z 移动"，以返回 TIRF 区域（图 3B 4）。在强光 LED（发光二极管）中添加电池的"快照"（图 2B 5）。
   2. 找到具有中等荧光标记蛋白表达水平的目标细胞，该细胞通过延长颗粒周围的质膜来启动 SRBC 的吞噬作用。
   3. 将其放在田地的中间。
   4. 开始流式传输 500 - 1,000 帧的采集。在"循环计数"选项卡中，输入"750 帧"（图 2B 1）.
      注意:ImageJ Color Profiler 软件用于处理 TIRF 图像流。
   5. 通过单击"文件"、"打开"并选择文件，在 Image J 软件中打开序列图像。
   6. 通过单击选项卡 "图像"、"Hyperstacks" 下拉菜单和 "Stack to hyperstack" 功能来分离通道。完成出现的窗口:Order: xyctz;通道 （c）:通道数（例如:如果您有两个荧光染料，则为"2"）;切片 （z）:z 轴上的切片数量（例如:如果 z 轴上没有移动，则为"1"）;帧 （t）:每通道数分割的图像数;显示模式:灰度.
      注意:生成两个单独的图像序列，对应于两个不同的通道。

图 1.TIRFM 分析的"吞噬体闭合测定"的示意图。吞噬体闭合测定使用瞬时表达一种或两种荧光标记蛋白的巨噬细胞进行。巨噬细胞沉积在非共价固定在聚赖氨酸包被的盖玻片上的 IgG 调理素 SRBC 上。在 TIRF 模式下记录图像以检测吞噬体闭合的部位，以落射荧光模式记录图像以检测吞噬杯的底部。

图 2:确定 TIRFM 的临界角。（A） 使用"活体采集"，将表达荧光标记蛋白的细胞放置在区域中间（区域 1 为红色）。使用 TIRF 堆栈选项，以一个激发波长采集图像，不同的角度从 0° 到 5°，增量为 0.01°（区域 2 为红色）。（B） 使用 ImageJ Color Profiler 软件打开图像序列，并使用"Stacks"和"PlotZ axis profile"（区域 1）用 x 轴上的角度函数绘制感兴趣区域 （ROI） 的平均荧光强度（区域 1 为红色）。（C） 图上荧光峰的 x 位置对应于临界角:1.98°（黑色虚线）。可以使用此角度之后的任何值。例如，可以选择 2.00°（红线）。

图 3.使用 Live Acquisition 模块的工作流程:"Protocol Editor"。（A） 在"Protocol Editor"窗口中，将创建一个工作流程画布。（B） 该协议包括一个"循环"动作，显微镜将重复用户决定的次数。例如:750 （1）。一个定量环包括:在 TIRF 模式下通过激光激发目标荧光蛋白进行"多通道"采集。例如:激光 491 nm 强度 50% -TIRF 角 2.00 （2）;物镜的"Z 移动" 3 μm （3）;落射荧光模式下的"多通道"采集 （4）;物镜的"Z 移动"回到 TIRF 区域 （5） 和透射光下的"快照"（6）。