一种体外评估单核细胞对白细胞增殖免疫调节作用的实验方法

摘要

来源：Hsu, P.，等。人源间充质干细胞（MSCs）免疫调节特性的评估。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种 体外 探索间充质干细胞（MSCs）对效应T细胞增殖免疫调节作用的检测方法。该检测包括将MSCs与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，以诱导单核细胞群体获得免疫调节表型，进而分泌白细胞介素-10（IL-10）。随后与活化的CD4⁺ T细胞，诱导的单核细胞能有效抑制T细胞增殖。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 人外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度分离

1. 用 25 ml 移液管将 25 ml 肝素化全血加入 50 ml 离心管中。
   1. 用 25 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释细胞。
2. 在新的 50 ml 离心管中加入 15 ml Ficoll-Paque 密度梯度液，倾斜离心管，缓慢而小心地将 25 ml 稀释后的细胞悬液沿管壁加入密度梯度液上方，避免全血与密度梯度液混合， 即，不扰动血液与密度梯度液之间的界面。
3. 将步骤 1.2 的悬液在 20 °C 下，以 400 × g 离心 30 至 40 分钟，使用温控水平转子离心机，离心过程中不使用刹车。
   注意：离心后应出现三层明显分层：上层为血浆；下层透明层为 Ficoll-Paque 密度梯度液；中间薄层细胞层为外周血单个核细胞（PBMCs）。
4. 用巴斯德吸管小心吸取并弃去上层液体，注意不要扰动单个核细胞的界面层（即 淋巴细胞、单核细胞和血小板）。
5. 用 10 ml 移液管小心收集该单个核细胞层，转移至新的 50 ml 离心管中。
6. 向离心管....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	用于分离外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度介质
Vibrant CFDA-SE 细胞示踪试剂盒（CFSE）	Life Technologies	V12883	用于检测细胞分裂的细胞标记物
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	用于激活人T淋巴细胞，例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	基于磁性的细胞分离仪
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	分离柱
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	用于从PBMCs中正向筛选人CD14+单核细胞和巨噬细胞
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	用于从PBMCs中正向筛选人CD4+ T淋巴细胞
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875	人PBMC/白细胞培养培养基
DMEM，低糖，含丙酮酸钠	Life Technologies	11885	人间充质干细胞（MSC）培养培养基
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081	MSC完全培养基的补充成分
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063	PBMC/白细胞及MSC完全培养基的补充成分
胎牛血清（FBS）	1) Hyclone，用于MSC培养；2) Life Technologies，用于其他所有细胞（即PBMCs、特定白细胞亚群）	1) SH30070.03M 2) 10091-148	预测试批次以支持MSC体外培养
24孔细胞培养板	Corning	COR3524	共培养板
50 mL 离心管	Corning	430291	使用Ficoll-Paque PLUS从全血中分离PBMCs
15 mL 离心管	Corning	430766	收集标记和未标记的细胞组分
圆底管	BD Falcon	352008	用于流式细胞术分析的细胞收集