一种体外评估单核细胞对白细胞增殖免疫调节作用的实验方法

摘要

来源：Hsu, P.，等。人源间充质干细胞（MSCs）免疫调节特性的评估。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种 体外 探索间充质干细胞（MSCs）对效应T细胞增殖免疫调节作用的检测方法。该检测包括将MSCs与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，以诱导单核细胞群体获得免疫调节表型，进而分泌白细胞介素-10（IL-10）。随后与活化的CD4⁺ T细胞，诱导的单核细胞能有效抑制T细胞增殖。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 人外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度分离

1. 用 25 ml 移液管将 25 ml 肝素化全血加入 50 ml 离心管中。
   1. 用 25 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释细胞。
2. 在新的 50 ml 离心管中加入 15 ml Ficoll-Paque 密度梯度液，倾斜离心管，缓慢而小心地将 25 ml 稀释后的细胞悬液沿管壁加入密度梯度液上方，避免全血与密度梯度液混合， 即，不扰动血液与密度梯度液之间的界面。
3. 将步骤 1.2 的悬液在 20 °C 下，以 400 × g 离心 30 至 40 分钟，使用温控水平转子离心机，离心过程中不使用刹车。
   注意：离心后应出现三层明显分层：上层为血浆；下层透明层为 Ficoll-Paque 密度梯度液；中间薄层细胞层为外周血单个核细胞（PBMCs）。
4. 用巴斯德吸管小心吸取并弃去上层液体，注意不要扰动单个核细胞的界面层（即 淋巴细胞、单核细胞和血小板）。
5. 用 10 ml 移液管小心收集该单个核细胞层，转移至新的 50 ml 离心管中。
6. 向离心管中加入 PBS 至总体积达 20 ml，充分混匀后在 20 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。离心后完全去除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于 20 ml PBS 中，在 20 °C 下以 200 × g 离心 10–15 分钟。离心后完全去除上清液。
   注意：此步骤可去除 PBMCs 中不需要的血小板；可重复此步骤以确保血小板完全去除。
8. 若无需对特定细胞群进行分选，则在进行细胞计数后，将细胞沉淀重悬于白细胞完全培养基（RPMI-1640 培养基含 10% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素/链霉素）中进行培养，每 10⁷ PBMCs 加入 1 ml 培养基，然后进行下一步操作。

2. 白细胞群体的磁性标记

1. 将PBMC悬液在300 × g下离心10分钟，彻底吸除上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于每 10⁶ 个细胞 80 µl 的 PBS 中⁷ 总细胞数
3. 加入20 µl指定的磁珠（即， CD14磁珠用于单核细胞分离，CD4磁珠用于T淋巴细胞分离，每10⁷ 总细胞数
4. 充分混匀，于2至8 °C冰箱中孵育15分钟。
5. 每 10 添加 1–2 ml PBS⁷ 细胞洗涤，300 × g 离心 10 分钟。
6. 吸弃上清液，完全去除后重悬至最多10⁸ 500 µl PBS 中的细胞

3. 白细胞亚群的磁选法

注意： 可通过多种厂商提供的磁珠分离器和柱子，根据细胞表面标志物从白细胞中分离特定细胞群。分离可通过基于一个或少数阳性标志物的阳性选择法，或通过去除不需要的细胞群后的阴性选择法实现。以下概述了使用单一标志物进行阳性选择的一般操作流程（例如， CD4 用于辅助性T淋巴细胞，或 CD14 用于单核细胞）。

1. 按照制造商的说明准备并预处理磁性分离器及分离柱。
2. 将含有标记的PBMC样本的管子置于分离器上。根据制造商的说明，准备两个15 ml离心管，用于收集正向标记和未标记的细胞组分。
3. 计数细胞数量 ，并用完全白细胞培养基重悬经阳性选择的白细胞（即 CD4⁺ T淋巴细胞或CD14⁺ 细胞），每10⁷ 细胞使用1 ml培养基。

4. 使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记白细胞以评估增殖

注意：CFSE 已广泛应用于免疫学研究，适用于 体内 和 体外 研究。本方案已针对间充质干细胞/外周血单个核细胞（或其他白细胞）相互作用的体外研究进行了优化。尽管进行CFSE体外标记的一般步骤相似，但具体剂量和操作时间可能有所不同，这可能由多种因素导致， 例如 所使用的特定细胞类型、细胞数量——这些因素可能会影响CFSE荧光信号的强度。

1. 将CFSE储备液（10 mM）用PBS稀释至所需的使用浓度10 µM（CFSE使用液）。准备10⁷ 细胞（即， PBMC 或 T 细胞）用 CFSE 工作液进行标记。
2. 以 300 × g 离心 10 分钟，获得细胞沉淀，并吸除上清液。
3. 轻轻将细胞重悬于1 ml预热（37 °C）的CFSE工作液中，于37 °C孵育10分钟。
4. 为去除多余的CFSE，加入预冷（4 °C）的含10% FBS的RPMI培养基，按体积稀释10倍。在300 × g离心5分钟，沉淀细胞，并弃去上清液。以相同方式再洗涤细胞沉淀两次。
5. 通过离心重新沉淀细胞并计数细胞数量。重悬10⁷ 细胞（PBMCs 或 T 细胞）置于 1 ml 新鲜预热的白细胞完全培养基中。

5. 效应细胞抑制实验：经磁珠分选的间充质干细胞诱导的免疫调节性白细胞对活化CFSE标记的效应性CD4+ T细胞的抑制作用 ⁺ T细胞

1. 将MSCs以250,000个细胞接种于3 6 孔板中加入 MSC 完全培养基（MSC 密度：25,000 个细胞/cm²）²) 在37 °C培养箱中孵育过夜，使干细胞达到80%汇合度。  至少需要3块6孔板，以确保有足够的MSC共培养PBMC用于亚群筛选。 
2. 吸弃培养基，加入按步骤1分离得到的PBMCs 但在6孔板中，每孔接种2.5 × 10⁶ 细胞/孔（细胞密度：250,000 白细胞/cm²）²用3 ml白细胞完全培养基重悬，于37 °C培养箱中共同培养48–72小时。
3. 磁珠筛选间充质干细胞诱导的免疫调节性白细胞特定亚群即， CD14⁺ 细胞）按照第2-3节进行操作。
   注意： 此时可进行细胞内细胞因子染色，用于流式细胞术分析，以评估白细胞细胞因子表达谱的变化。 即， 间充质干细胞调控的白细胞介素-10表达
4. 加入CFSE标记的同种异体CD4⁺ 按照第2-4节在24孔板中生成的T细胞 白细胞完全培养基毫升数（T细胞密度：250,000 个细胞/cm）²) 以不同比例加入磁珠筛选的MSC诱导的白细胞， 即， 1:10、1:5、1:2 和 1:1（细胞与细胞）比例。
5. 为了刺激 CD4⁺ T细胞，加入与α-CD3/28偶联的微珠，使微珠与细胞的比例为1:1。
6. 作为阴性对照，接种 500,000 个 CD4⁺ 24 孔板中每孔的 T 细胞数（T 细胞密度：250,000 个细胞/cm²）²) 仅加入1 ml白细胞完全培养基；阳性对照组除接种相同数量的CD4⁺ 每孔加入 T 细胞，添加与 α-CD3/28 偶联的微珠，使微珠与细胞的比例为 1:1。
7. 第3天^rd 共培养当天，评估CFSE标记的CD4细胞增殖情况⁺ 通过流式细胞术分析T细胞（置于圆底管中） 使用488 nm激发光和适用于荧光素的发射滤光片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	用于分离外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度介质
Vibrant CFDA-SE 细胞示踪试剂盒（CFSE）	Life Technologies	V12883	用于检测细胞分裂的细胞标记物
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	用于激活人T淋巴细胞，例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	基于磁性的细胞分离仪
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	分离柱
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	用于从PBMCs中正向筛选人CD14+单核细胞和巨噬细胞
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	用于从PBMCs中正向筛选人CD4+ T淋巴细胞
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875	人PBMC/白细胞培养培养基
DMEM，低糖，含丙酮酸钠	Life Technologies	11885	人间充质干细胞（MSC）培养培养基
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081	MSC完全培养基的补充成分
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063	PBMC/白细胞及MSC完全培养基的补充成分
胎牛血清（FBS）	1) Hyclone，用于MSC培养；2) Life Technologies，用于其他所有细胞（即PBMCs、特定白细胞亚群）	1) SH30070.03M 2) 10091-148	预测试批次以支持MSC体外培养
24孔细胞培养板	Corning	COR3524	共培养板
50 mL 离心管	Corning	430291	使用Ficoll-Paque PLUS从全血中分离PBMCs
15 mL 离心管	Corning	430766	收集标记和未标记的细胞组分
圆底管	BD Falcon	352008	用于流式细胞术分析的细胞收集