基质细胞对白细胞募集影响的体外流动研究

摘要

来源：Munir, H. 等，分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了一种研究基质细胞对白细胞募集影响的方法。在平行板流动腔模型中，促炎性细胞因子诱导内皮细胞表达黏附受体，从而促进中性粒细胞的募集和迁移。基质细胞与内皮细胞之间的相互作用会减弱中性粒细胞向内皮细胞的募集。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 原代人内皮细胞和间充质干细胞的分离与培养

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离与培养
   1. 将脐带置于铺有纸巾的托盘上，并用70%乙醇喷洒。放入组织培养罩中。辨认静脉并在两端进行插管。在插管端用扎带固定。
   2. 用注射器以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗静脉血。将注射器内充满空气，通过静脉推注以清除并弃去残留的PBS。
   3. 解冻 10 mg/ml 的 Ia 型胶原酶，用含氯化钙和氯化镁的 PBS 按 1:10 稀释，使其终浓度为 1 mg/ml。将胶原酶溶液经静脉注入，直至两端套管均充满。关闭两端套管上的夹子。
   4. 用组织覆盖托盘，并喷洒70%乙醇。将脐带放入37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中孵育20分钟。₂).
   5. 将脐带从培养箱中取出，扎紧扎带。轻轻按摩脐带1分钟。用10 ml PBS冲洗出细胞悬液，并收集至50 ml离心管中。
   6. 用空气充满注射器，通过静脉冲洗两次以去除任何残留的PBS，并将PBS收集到已使用的50 ml离心管中 步骤 1.1.5在室温（RT）下以400 × g离心5分钟。
   7. 吸弃上清液，将沉淀物重悬于1 ml完全内皮细胞（EC）培养基中。EC培养基由M199添加35 µg/ml硫酸庆大霉素、10 ng/ml人表皮生长因子、1 µg/ml氢化可的松、2.5 μg/ml两性霉素B以及20%胎牛血清组成。
   8. 加入4 ml EC培养基和EC悬液至25 cm²培养瓶中² 培养瓶。次日更换培养基，之后每2天更换一次。
   9. ECs 呈现鹅卵石样形态（图1Ai）。在黏附实验中，内皮细胞通常在达到100%汇合度时进行接种（参见 第1.4节).
2. 从人脐带中分离华通胶间充质干细胞（WJMSC）：
   1. 从新鲜脐带或已用于分离内皮细胞（EC）的脐带中分离华通氏胶来源的间充质干细胞（WJMSC）。将脐带切成5 cm长的片段。沿纵轴切开每个片段，暴露其中的血管（2条动脉，呈白色、质地较硬；1条静脉，呈黄色、扩张状）。
   2. 使用无菌剪刀和镊子去除血管并弃去。将所有组织切成 2 - 3 mm³ 碎片。用镊子取 2 - 3 mm³ 将碎片放入一个50 ml离心管中。
   3. 解冻100 mg/ml的II型胶原酶储备液，用10 ml PBS按1:100稀释，终浓度为1 mg/ml。解冻20,000 U/ml的透明质酸酶储备液，按1:400稀释至胶原酶溶液中，终浓度为50 U/ml。
   4. 向含有组织碎片的离心管中加入酶混合液。将组织碎片置于37 °C缓慢旋转摇床上孵育5小时。
   5. 将细胞悬液用PBS按1:5比例稀释。将孔径100 µm的滤膜放入新的50 ml离心管中。将细胞悬液倒入孔径100 µm的滤膜上。
      注意： 剩余的组织碎片将留在滤膜上，细胞则收集于50 ml离心管中。
   6. 弃去滤膜。将细胞悬液在室温下以400 × g离心10分钟。吸除上清液，将WJMSC沉淀重悬于12 ml完全WJMSC培养基中（DMEM低糖培养基、10%胎牛血清（FCS）和100 U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素混合液）。
   7. 将所有细胞接种于75 cm²培养瓶中² 组织培养瓶。24小时后更换培养基，加入12 ml完全WJMSC培养基。每2-3天更换一次培养基。细胞应在2周内达到70-80%融合度。当WJMSC达到70-80%融合度时进行传代（参见 第1.4节).
3. 骨髓来源间充质干细胞（BMMSC）的扩增：
   1. 按照先前所述方法分离人骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）。向15 ml离心管中加入10 ml预热的间充质干细胞培养基（MSCGM）。
   2. 将一管p2代BMMSC置于37 °C水浴中2分钟以解冻。将BMMSC悬液加入含有MSCGM的离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
   3. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。彻底吸除上清液。
   4. 用1 ml MSCGM重悬细胞，并使用血细胞计数板或细胞计数仪（如cellometer）对细胞进行计数。
   5. 将种子细胞接种至75 cm²培养瓶中² 培养瓶中的细胞密度为每平方厘米5,000 - 6,000个细胞² 在12 ml MSCGM中培养。24小时后更换为12 ml MSCGM。每隔2-3天用12 ml MSCGM换液。
   6. 当BMMSC达到70%–80%融合度时传代（参见 第1.4节）。细胞呈现成纤维细胞样形态（图1Aii).
4. 内皮细胞和间充质干细胞的分离：
   1. 吸出 25 cm² 培养瓶中的培养基² 培养瓶。加入2 ml 0.02%的乙二胺四乙酸（EDTA），作用约2分钟。吸除EDTA，加入2 ml胰蛋白酶（2.5 mg/ml）。在显微镜下观察，直至细胞变圆。
   2. 轻敲培养瓶以使细胞脱落。加入8 ml培养基（根据细胞类型而定：HUVEC使用EC培养基，WJMSC使用DMEM低糖培养基，BMMSC使用MSCGM培养基）以终止胰酶消化，将悬液转移至15 ml离心管中。
   3. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，并按如下所述重悬沉淀。
      1. 对于MSC的传代，将沉淀重悬于3 ml培养基中。向三个独立的75 cm²培养瓶中各加入11 ml培养基。² 培养瓶。向每个培养瓶中加入1 ml细胞悬液（1:3传代）。使用前，将WJMSC和BMMSC连续传代3次（p3）。
      2. 用于在粘附实验中接种EC或MSC——参见 第2节 和 3.
5. 冻存间充质干细胞：
   1. 第3代时，按照所述方法解离MSC 第1.4节吸弃上清液，加入3 ml预冷的CryoSFM重悬细胞。将细胞悬液用移液器分装至预冷的1.5 ml冻存管中，每管1 ml。将冻存管放入冻存盒中。
   2. 将容器于 -80 °C 过夜保存，随后转移至液氮中。解冻一管 MSC（遵循 步骤 1.3.1 - 1.3.6）。将MSC重悬于5 ml培养基中（根据WJMSC或BMMSC选择合适的培养基），接种至25 cm²培养瓶中² 烧瓶

2. 在滤膜上建立内皮细胞-间充质干细胞共培养体系

1. 按照第1.4节所述方法消化分离WJ或BMMSC。将细胞沉淀重悬于1 ml MSCGM培养基中。使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。
2. 调整体积，使最终浓度为5 × 10⁵ 个MSC溶于500 µl MSCGM中。
3. 使用无菌镊子将6孔0.4 µm PET Transwell小室滤膜翻转，并置于无菌盒中。
4. 将5 × 10⁵ 个MSC接种至滤膜外表面。于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
5. 收集滤膜外表面的培养基，计数其中未贴壁的MSC数量。使用无菌镊子重新将滤膜翻转，并将其放入含有3 ml MSCGM的配套6孔板中。
6. 在滤膜内表面加入2 ml MSCGM（图1B）。将板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。同时对汇合的25 cm²培养瓶中的EC进行胰酶消化（图1Ai；操作见第1.4节）。
7. 将EC重悬于8 ml MSCGM中（1个25 cm²培养瓶可接种4个6孔Transwell滤膜；每孔约5 × 10⁵ 个EC）。吸除滤膜上下两室的培养基。向下方腔室（滤膜下方）加入3 ml新鲜MSCGM。向每个滤膜内表面加入2 ml EC悬液。于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
8. 吸除培养基以洗去未贴壁的EC，并更换为新鲜MSCGM。设置平行的EC单层培养对照组：仅在滤膜内表面接种EC，不预先接种MSC。于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。
9. 检查EC单层是否完全汇合且无间隙。未完全汇合的单层不可用于黏附实验（图1B）。
10. 解冻1 × 10⁵ U/ml的肿瘤坏死因子-α（TNFα）储存液，用MSCGM按1:1,000稀释，得到终浓度为100 U/ml（相当于约10 ng/ml）。进一步进行系列稀释：将100 U/ml TNFα用MSCGM按1:10稀释，获得10 U/ml；再将10 U/ml TNFα用MSCGM按1:10稀释，获得1 U/ml。
11. 在实验开始前，于37 °C条件下，用1、10或100 U/ml TNFα（相当于约10 ng/ml）处理滤膜的上室和下室，孵育4小时。

3. 白细胞的分离

1. 从健康志愿者处采集静脉血，并立即分装至含EDTA的试管中。轻轻颠倒混匀。
2. 在10 ml圆底试管中，将2.5 ml Histopaque 1077叠加于2.5 ml Histopaque 1119之上。将5 ml全血小心叠加于Histopaque梯度上。在室温下以800 × g离心40分钟。
3. 在Histopaque 1077与1119的界面处（红细胞层上方）收集外周多形核中性粒细胞（PMN）。将其转移至10 ml圆底试管中，并用PBSA补至10 ml。轻轻颠倒混匀后，在室温下以400 × g离心5分钟。
4. 将7.5% BSA溶液用100 ml PBS（含氯化钙和氯化镁）按1:50稀释，得到终浓度为0.15%（w/v；PBSA）。吸除上清液，用10 ml PBSA重悬细胞。在室温下以400 × g离心5分钟。
5. 用1 ml PBSA重悬细胞。取20 µl细胞悬液加入380 µl PBSA中（1:20稀释），使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。在PBSA中调整至所需浓度（Transwell滤膜和Ibidi微孔板实验使用1 × 10⁶/ml）。实验前将中性粒细胞悬液置于室温保存。

4. 组装流动系统

1. 按照图1C所示设置流体系统。打开加热器并设定为37 °C。将一个20 ml注射器（移除推杆）和一个5 ml注射器连接至三通阀。使用Micropore胶带将三通阀固定到有机玻璃腔室上。
2. 测量并截取一段长约相当于阀门至三通阀之间距离的硅胶管（2/4 mm，厚壁）。再截取一段8–10 mm长的1/3 mm（薄壁）管，并将其插入厚壁管的一端。将厚壁管的另一端连接至三通阀。
3. 将薄壁管的末端连接至电子三通微阀的一个端口，作为“清洗液储液池”。另截取一段6–8 mm长的厚壁和薄壁管。
4. 将薄壁管插入厚壁管的一端。将厚壁管的另一端连接至一个2 ml注射器（移除推杆）。
5. 将2 ml注射器的薄壁管末端连接至电子微阀的另一个端口，构成“样品储液池”。通过测量并截取一段长度等于微阀至显微镜载物台中心距离的薄壁管，将微阀与滤膜流动腔室连接。
6. 对于微滑片（microslide）模型，将一段8–10 mm长的厚壁管连接至通向微滑片的薄壁管末端，并在厚壁管末端安装一个L型接头，用于连接微滑片。对于滤膜（filter）模型，将一段8–10 mm长的Portex Blue Line测压管连接至薄壁管末端。
7. 将薄壁管的末端连接至微阀，作为清洗液和样品储液池的公共出口。用PBSA填充储液池，并通过让PBSA流经整个管路系统以排除所有气泡，完成管路的预润。
8. 将测压管连接至一个29 mm（50 ml）玻璃注射器。先用10 ml PBSA充满该注射器以进行预润。将注射器倒置，使连接管路的一端朝上，排出所有气泡，然后重新加入5 ml PBSA。
9. 仅针对微滑片模型，将一段10–12 mm长的厚壁管连接至通向玻璃注射器的测压管末端，并在厚壁管末端安装一个L型接头。将玻璃注射器放入注射泵中，用于液体的注入或抽取。
10. 使用以下公式计算所需补充流速（Q），以产生目标壁面剪切应力（τ_w，单位为帕斯卡Pa）：0.1 Pa（Transwell滤膜）或0.05 Pa（Ibidi微滑片）：
    γ_w = (6 × Q) / (w × h²)
    τ = n × γ
    其中，w为流道内宽，h为流道内深，n为流动溶液的黏度；PBSA的黏度n = 0.7 mPa·s。对于平行板滤膜流动腔室，宽度（w）为4 mm，深度（h）为0.133 mm。由于所用Parafilm密封垫厚度存在差异，腔室深度可能略有变化。对于Ibidi微滑片，宽度为3.8 mm，深度为0.4 mm。
    注意：由于流动通道尺寸及捕获动力学的差异，微滑片模型与滤膜模型所采用的剪切应力不同。

5. 设置带有滤膜的平行板流动腔

1. 使用金属模板裁剪一块与玻璃盖玻片相同尺寸的Parafilm。使用金属模板在Parafilm上切出一个20 × 4 mm的狭缝（用于形成流动通道）。使用垫圈在玻璃盖玻片上标记流动通道的位置。
2. 将6孔滤膜的边缘与玻璃盖玻片对齐，确保滤膜覆盖住流动通道的标记位置。使用10A型手术刀小心地裁切滤膜。
3. 用Parafilm垫圈小心覆盖滤膜，确保流动通道狭缝位于滤膜中央（图1D）。用一块干净的纸巾轻压，排出任何气泡。
4. 将盖玻片放入亚克力流动室底板的凹槽中。将顶部亚克力板置于垫圈上方，并用螺丝将两块板固定在一起（图1D）。
5. 转动三通阀，使洗涤缓冲液（PBSA）流经阀门。将压力计管路连接到顶部亚克力板的入口端口，使PBSA流经流动通道，以排出气泡。
6. 将注射泵的压力计管路连接到亚克力板的出口端口。将注射泵设置为“灌注”模式并启动运行。清除滴落在流动室上板的任何PBSA液体。
7. 将流动室置于倒置相差显微镜的载物台上。调节焦距，观察滤膜上方的EC（图1B）。

6. 白细胞在内皮细胞上的灌注

1. 将2 ml纯化的中性粒细胞加入样品储液池中，静置温育2分钟。用PBSA冲洗内皮层2分钟。
2. 打开阀门，使中性粒细胞流经内皮层。持续输送中性粒细胞团块4分钟。关闭阀门，并从清洗储液池中继续灌注PBSA，直至实验结束。
3. 确保在实验过程中无气泡通过流动通道，否则会破坏内皮细胞单层并导致已黏附的中性粒细胞脱落。

7. 记录中性粒细胞的捕获与行为

1. 在中性粒细胞流动期间或灌注后记录中性粒细胞的募集情况。
2. 在流动通道中心区域至少采集5–10个视野的数字图像。通过将物镜移至入口端口处通道边缘并确定端口中心位置，来识别通道的中心。
   1. 若在中性粒细胞流动期间进行记录，对单个视野每10秒拍摄一次图像，持续1分钟；然后沿通道移动，对另一个视野继续记录1分钟。在整个团注持续期间重复此操作。
   2. 若在灌注后进行记录，在流动通道中心沿线选取5–10个视野，每个视野进行10秒录像，用于评估白细胞行为（通常在中性粒细胞团注结束后2分钟进行）。在10秒的时间段内每秒采集一次图像。这可为细胞从流动中被捕获以及黏附中性粒细胞的行为分析提供充足时间。
   3. 选取一个包含至少10个已迁移中性粒细胞的视野，持续记录5分钟，每30秒拍摄一次图像。该记录可用于计算迁移细胞的迁移速度（无论位于内皮上方或下方）。
   4. 再采集一组10秒时长的多个视野图像（通常在灌注后9分钟进行）。这可使中性粒细胞有足够时间穿过内皮单层。
   5. 停止注射泵并移除管路。拆卸流动室，冲洗样品储液槽和管路。随后对其他滤膜/显微滑道通道重复上述操作。

8. 白细胞募集与行为分析

1. 在2分钟时间点的10秒录像期间，计数每个视野中的中性粒细胞数量。只有在第一秒时已完全位于视野内的细胞才计入统计。对于部分位于视野两侧（例如，顶部/右侧边界）的细胞，只要其在完整的10秒内始终保留在视野中，也应计入总数。
2. 计算每视野平均黏附的中性粒细胞数。测量所记录视野的长度和宽度，计算视野面积，确定1 mm²内包含多少个视野。将平均中性粒细胞数乘以1 mm²内的视野数。
3. 通过将灌注的中性粒细胞数量（例如，2 × 10⁶/ml*Q [例如，平行板流动腔为0.0999 ml/min]）乘以脉冲持续时间（例如，4 min），计算灌注的中性粒细胞总数。
4. 将每平方毫米黏附的中性粒细胞数（neutrophil count/mm²）除以灌注的中性粒细胞总数，以确定发生黏附的细胞比例（黏附细胞数/mm² / 10⁶ 灌注细胞）。
5. 评估黏附的中性粒细胞是处于滚动、牢固黏附还是已发生跨内皮迁移状态。
   1. 滚动的中性粒细胞呈相位明亮，沿内皮单层缓慢移动（1 – 10 µm/sec）。
   2. 牢固黏附的细胞呈相位明亮并结合于内皮细胞（EC）表面，表现为静止不动（即在录像期间无移动），或已发生形态改变并在内皮细胞表面迁移（图1Ei）。
   3. 已跨内皮迁移的中性粒细胞呈相位暗淡，位于内皮细胞层下方（图1Eii）。
6. 计算处于滚动、静止和跨内皮迁移状态的黏附细胞所占百分比。或者，也可通过应用与计算总黏附量相同的公式（如步骤8.6 – 8.7所述），将中性粒细胞行为表示为表现出不同行为的细胞总数。
   1. 标记一个滚动中性粒细胞的前缘，在10秒序列结束时再次标记同一细胞的前缘。连接两点并测量细胞移动的距离。
   2. 将该距离除以细胞滚动的录像持续时间（即，10秒）。尽量选择在整个10秒区间内均保留在视野中的中性粒细胞进行分析。
7. 为计算在内皮表面迁移（形态改变、相位明亮）或在内皮下迁移（相位暗淡）的中性粒细胞速度，使用5分钟的录像资料。
   1. 在序列开始时描绘迁移细胞的轮廓，并在整个序列中追踪其运动轨迹。记录每个细胞在每1分钟时间点的质心X和Y坐标位置。用第二幅图像的X和Y坐标值减去序列第一幅图像的对应值。此计算基于勾股定理。
   2. 再用第三幅图像的X和Y值减去第二幅图像的对应值，依此类推处理序列中所有图像。将各步所得X和Y差值分别平方后相加。
   3. 对所得总和取平方根。通过平均每一分钟间隔计算出的速度，得到每个细胞的平均迁移速度。追踪10个已迁移的中性粒细胞，并计算其平均速度。

结果

图1. 建立内皮细胞-间充质干细胞共培养体系，并利用基于流动的黏附实验分析中性粒细胞募集。（A） 在组织培养瓶中培养的 （i） 原代内皮细胞和 （ii） 第3代骨髓来源间充质干细胞（BMMSC）的显微图像。（B） 在6孔Transwell小室滤膜上共培养的内皮细胞和间充质干细胞的显微图像。（C） 用于产生流动的灌注系统示意图。（D） 平行板滤膜流动室的示意图。（E） 在100 U/ml TNFα刺激的内皮细胞上，经流动条件下募集后，

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 Ia 型	Sigma	C2674	用 10ml PBS 稀释，得到终浓度为 10mg/ml。分装为 1ml 每份，于 -20°C 保存。
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Sigma	D8662	含氯化钙和氯化镁。保持无菌，室温保存。
1X M199 培养基	Gibco	31150-022	使用前在 37 °C 水浴中预热。
硫酸庆大霉素	Sigma	G1397	4°C 保存。加入 500ml M199 培养基瓶中。
人表皮生长因子	Sigma	E9644	分装为 10µl 每份，于 -20°C 保存。
胎牛血清（FCS）	Sigma	F9665	FCS 必须进行批次测试，以确保分离的内皮细胞（EC）的生长和存活率。在 56°C 下热灭活。分装为 10ml 每份，于 -20°C 保存。
两性霉素 B	Gibco	15290-026	活性强，一周内会变毒，因此必须每周新鲜配制完全 HUVEC 培养基。分装为 1ml 每份，于 -20°C 保存。
氢化可的松	Sigma	H0135	储存液溶于乙醇中。分装为 10µl 每份，于 -20°C 保存。
胶原酶 II 型	Sigma	C6885	用 PBS 稀释储存液至终浓度为 100mg/ml。分装为 100µl 每份，于 -20°C 保存。
透明质酸酶	Sigma	H3631	用 PBS 稀释储存液至终浓度为 20,000U/ml。分装为 100µl 每份，于 -20°C 保存。
用于 50ml 离心管的 100µm 细胞筛	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	也可使用其他市售的细胞筛（例如 Greiner bio-one）。
低糖 DMEM	Biosera	LM-D1102/500	使用前在 37 °C 水浴中预热。
青霉素/链霉素混合液	Sigma	P4333	分装为 1ml 每份，于 -20°C 保存。
25cm² 组织培养瓶	SLS	353109
75cm² 组织培养瓶	SLS	353136
骨髓间充质干细胞冻存管	Lonza	PT-2501	收到后立即存于液氮中。细胞到货时为第 2 代，但记为第 0 代。扩增至第 3 代后冻存于液氮中以备后续使用。
间充质干细胞生长培养基（MSCGM）	Lonza	PT-3001	使用前在 37 °C 水浴中预热。用于 Cell Tracker Green 染色时，使用不含 FCS 的培养基。
EDTA（0.02%）溶液	Sigma	E8008	4°C 保存。使用前在 37°C 水浴中预热。
胰蛋白酶溶液	Sigma	T4424	分装为 2ml 每份，于 -20°C 保存。室温解冻后立即使用。
冻存管	Greiner bio-one	2019-02	加入细胞悬液前保持在冰上。
Mr. Frosty 冷冻容器	Nalgene	5100-0001	室温保存。加入含细胞的冻存管后，于 -80°C 保存 24 小时，再转移至液氮中。
Cell tracker green 荧光染料	Life technologies	C2925	分装为 5µl 每份，于 -20°C 保存。用 5ml 预热至 37°C 的 MSCGM 稀释。
细胞计数板	Nexcelom	SD-100	也可使用血细胞计数板。
Cellometer auto T4 细胞计数仪	Nexcelom	Auto T4-203-0238
肿瘤坏死因子 α（TNFα）	R&D Systems	210-TA-100	用 PBS 稀释储存液至终浓度为 100,000U/ml。分装为 10µl 每份，于 -80°C 保存。
6 孔 0.4µm PET Transwell 小室	SLS	353090
含 K2-EDTA 的 10ml 采血管	Sarstedt		室温保存。
Histopaque 1119	Sigma	11191	4°C 保存。使用前恢复至室温。
Histopaque 1077	Sigma	10771	4°C 保存。使用前恢复至室温。
10ml 圆底试管	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA 第 V 组分溶液	Life technologies	15260-037	4°C 保存。
20ml Plastipak 注射器	BD falcon	300613
5ml Plastipak 注射器	BD falcon	302187
2ml Plastipak 注射器	BD falcon	300185
3M 低致敏外科胶带 9m × 2.5cm	Micropore	1530-1	用于将注射器固定在亚克力腔室壁上。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）1/3mm（细管）	Fisher Scientific	FB68854	将硅胶管剪裁至合适长度。所有直接连接至电子微阀的管路必须使用细管。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）2/4mm（粗管）	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line 压力测量管	Smiths	200/495/200	连接至注射泵的管路。
三通旋塞阀	BOC Ohmeda AB
用于泵的玻璃 50ml 注射器	Popper Micromate	550962	使用前必须排气，确保无气泡。
玻璃盖玻片	Raymond A Lamb		定制 26×76mm 盖玻片。批号 2440980。
Parafilm 密封垫圈	American National Can Company		使用铝制模板裁剪 26×76mm 的 Parafilm 片，再用 10a 型手术刀切出 20×4mm 的槽口。垫圈厚度约为 133µm。
两块亚克力平行板	Wolfson Applied Technology Laboratory		特制腔室，由 8 个螺丝固定两块平行板组成。下板中央设有观察窗，并铣出浅槽以容纳盖玻片、滤膜和垫圈。上亚克力板在流道上方设有进样口和出样口。
电子三通微阀（最小死体积）	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	电子连接至 12 伏直流电源。
输注/抽吸用注射泵（PHD2000）	Harvard Apparatus	70-2001	设置直径为 29mm，并设定灌注（流动）速率。
L 型连接器	Labhut	LE876	用于连接 Ibidi 微流通道的进样口和出样口。
视频摄像机	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	连接至计算机，可记录数字视频。
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	用于数据分析。手动标记表现出不同行为的细胞。追踪细胞以分析滚动和迁移速度。