基于流式细胞术的治疗诱导的衰老癌细胞定量

摘要

来源:Flor， A. 等人 Far-Red 荧光衰老相关 β-半乳糖苷酶探针，用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞。 J. Vis. Exp. （2022 年）

该视频演示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于定量具有双重衰老标志物的治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测和定量涉及使用 β-半乳糖苷酶底物。底物在衰老细胞内被活性溶酶体 β-半乳糖苷酶裂解，产生荧光产物，该产物与自发荧光脂褐素颗粒一起标记衰老癌细胞。

方案

1. 化疗药物对培养癌细胞衰老

的诱导

注意:本节中的所有细胞作步骤都应在生物安全柜中使用无菌作方法进行。本节针对贴壁细胞类型编写。悬浮细胞可以按照说明进行适当的修改。

1. 根据供应商或提供所用特定细胞系的实验室的标准方案培养癌细胞系><。 注意:通常首选低传代细胞 （p < 10），因为在未处理的细胞样品中，复制衰老水平较低，即背景较低。
2. 在药物诱导衰老前一天，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（或按照推荐）收获细胞。通过添加等体积的完全培养基中和胰蛋白酶，并将细胞悬液转移到无菌锥形管中。
   注意:悬浮细胞不需要此步骤。
3. 使用标准血细胞计数器方法对细胞进行计数并记录细胞/mL。在标准 6 孔塑料培养皿中，以 1 ×^{10 3-10} ×^{10 3} cells/cm² 的浓度接种细胞><。 注意:最佳铺板密度取决于细胞的增殖速率，应由用户确定。细胞应在处理时（即，接种后孵育 18-24 小时后）以大约 10%-20% 的汇合度处于对数期生长。悬浮细胞的起始密度 （cells/mL） 应由用户确定。六孔板通常每孔产生的衰老细胞足以用于一个标准流式细胞术分析样品。如果进行流式分选，则应使用更大的表面积（例如，多个 P150 板）来回收足够数量的衰老细胞用于下游检测 （≥1 × 10⁶）。
4. 将铺板的细胞在 37 °C 培养箱中（18-24 小时），含 5% CO₂ 和湿度盘
。
5. 用诱导衰老的化疗药物治疗铺板的细胞。包括至少一种阳性对照，例如依托泊苷 （ETO） 或博来霉素 （BLM）。每种药物准备重复的孔。包括一组仅作为 control-only 处理的 Vehicle.
   注意:用户应测试每种实验药物的剂量曲线，以确定所用细胞系中衰老诱导的最佳浓度。
6. 将细胞在 37 °C 培养箱中，加入 5% CO₂ 和湿度盘孵育 4 天，以允许衰老开始。每天使用光学显微镜检查预期的形态变化。
   注意: 根据衰老发生的速度，3-5 天的孵育时间可能是可以接受的。可以根据需要更换培养基并重新涂抹（或不涂抹）试剂，以促进健康的生长条件，同时达到可接受的衰老细胞百分比。
7. 衰老开始后，通过在 37 °C 下加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 5 分钟来收获细胞。当细胞解离成悬浮液时，用等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。
   注意: 在悬浮液中生长的细胞不需要此步骤。如果要进行表面标志物染色，请避免使用胰蛋白酶-EDTA，因为它会暂时破坏细胞上的表面抗原。相反，使用无菌塑料细胞刮刀（或旨在保留表面抗原的替代解离试剂）轻轻解离单层。
8. 使用血细胞计数器对每个样品中的细胞进行计数。计算每个样品的细胞数/mL。
   注意: 此时可以添加台盼蓝来评估死细胞的百分比（即，由于药物治疗），但在 DDAOG 染色工作流程中，细胞死亡也将用荧光活力染料确定。
9. 将 ≥0.5 × 10⁶ 个细胞分装到 1.7 mL 微量离心管中><。 注意: 每个样品的细胞数量应在所有样品中标准化。
10. 将试管在 4 °C 的微量离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟。去除上清液。
    注意:如果没有冷冻微量离心机，对于某些弹性细胞类型，在环境温度下进行离心可能是可以接受的。
11. 继续进行第 2 部分的 DDAOG 染色。

2. 细胞样品中 SA-β-Gal 的 DDAOG 染色

1. 将 1 mM 巴弗洛霉素 A1 储备液以 1:1,000x 稀释到 DMEM 培养基（不含 FBS）中，终浓度为 1 μM。
2. 将制备好的 Baf-DMEM 溶液添加到细胞沉淀样品中（来自步骤 1.11），浓度为 1 ×^{10 6} 个细胞/mL><。 注意:例如，如果每个样品使用 0.5 × 10⁶ 个细胞，则添加 0.5 mL 的 Baf-DMEM。
3. 在 37 °C（无 CO₂）下在旋转器/振荡器上以慢速孵育 30 分钟><。 注意:染色过程避免使用 CO₂ 培养箱，这会使溶液酸化，从而干扰 Baf 和 DDAOG 染色。
4. 不洗涤，向每个样品中加入 1:500x（最终浓度为 10 μg/mL）的 DDAOG 储备液 （5 mg/mL）。移液管混合。在 37 °C（无 CO₂）下更换旋转器/振荡器 60 分钟。避免阳光直射。
5. 将试管在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟。去除上清液。
6. 每管用 1 mL 冰冷的 0.5% BSA 洗涤，然后移液管混合。将试管在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟，然后除去上清液。重复此步骤 2 次以彻底洗涤细胞。去除上清液并继续。
   注意: 重要的是执行步骤 2.6 中的洗涤步骤以去除未切割的 DDAOG，它可能表现出不需要的荧光发射 （460/610 nm）。
7. （可选）固定和储存 DDAOG 染色细胞以备后用
   1. 向每个洗涤的样品中滴加 0.5 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛。移液管混合。
   2. 在室温下孵育 10 分钟。
   3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次。
   4. 在流式细胞术分析之前，将样品在 4 °C 下储存长达 1 周><。 注意:对于固定样品，跳过步骤 2.8。
8. 将钙黄绿素紫 450 AM 储备液 （1 mM） 以 1:1,000 倍稀释到 1% BSA-PBS（终浓度 1 μM）中。在步骤 2.6 中向洗涤的细胞沉淀中加入 300 μL（用于培养的细胞样品）。在黑暗中的冰上孵育 15 分钟。
9. 继续进行流式细胞术设置（第 3 节）。

3. 流式细胞仪设置和数据采集

1. 将细胞样品转移到与流式细胞术仪器兼容的试管中。将试管放在冰上并避光。
   注意:如果在细胞悬液中观察到聚集体，请在分析前将悬浮液通过 70-100 μm 细胞过滤器。不要使用 40 μm 过滤器，因为它们可以排除一些较大的衰老细胞。
2. 在参考软件（参见材料表）中，打开以下图:1） FSC-A 与 SSC-A 点图，2） 紫色通道直方图，3） 远红通道（例如 APC-A）与绿色通道（例如 FITC-A）点图><。 注意:也可以使用双峰排除图和单通道直方图，但并非严格要求。
3. 启动细胞仪数据采集。
   1. 将用 DDAOG 染色的车辆专用对照样品放在进气口上。以较低的进样速度开始采集样品数据。
   2. 调整 FSC 和 SSC 电压，使 >90% 的事件包含在图中。如果单元格在绘图上不太适合，请将面积缩放设置降低到 0.33-0.5 个单位。
   3. 删除仅车辆样本而不记录数据。
   4. （可选）将一滴彩虹校准微球加入含有 1 mL PBS 的细胞仪管中。将试管放在细胞仪进气口上。开始采集样本数据。
   5. 调整紫色、绿色和远红通道电压，使彩虹微球的顶峰在每个通道中处于 104-105 个单位的相对荧光范围内，并且每个通道中的所有峰都很好地分离。记录 10000 个事件。拆下管子。
4. 将用 DDAOG 染色的阳性对照样品（例如，BLM、ETO）放在进样口上。以低速采集样本数据。观察 FSC、SSC、紫色、绿色和远红通道中的事件，以确保超过 90% 的事件包含在所有图中。与仅车辆控制相比，寻找 AF 和 DDAOG 信号的增加。
5. 如果使用分选细胞仪，请在此步骤开始分选。
   1. 出于记录保存目的，请记录对照样品和每个已排序样品的 10,000 个细胞。
   2. 将所需数量的细胞（≥1 × 10⁶ 通常合适）分选到装有 3-5 mL 培养基的仪器合适的收集管中。
   3. 分选后，进行下游培养或分析。
      注意:对于本文使用的校准流式细胞仪，最佳通道电压通常在 250 到 600（中间范围）之间，但最佳电压和通道电压范围会因仪器而异。避免使用非常低或非常高的电压，这可能会抑制信号或放大噪声。
6. 完成步骤 3.1-3.5 并根据需要调整细胞仪设置后，记录所有样品的数据。确保所有样本记录的设置保持一致。每个培养细胞样本记录 ≥10,000 个事件。
   注意:尽管可以使用数据采集软件（例如 FACSDiva）进行门控和分析，但下面的第 4 节描述了使用单独的分析软件 （FlowJo） 在采集后进行的完整门控和分析工作流程。采集后分析是首选，以减少细胞仪工作站的时间并利用专用分析软件中包含的其他工具。
7. 以 .fcs 文件格式保存示例数据。将文件导出到配备有流式细胞术分析软件（例如 FlowJo）的工作站计算机。

4. 流式细胞术数据分析

注意:介绍的工作流程使用 FlowJo 软件。如果同样遵循本节中描述的关键步骤，则可以使用替代的流式细胞术数据分析软件。

1. 使用 FlowJo 软件，打开步骤 3.7 中的 .fcs 数据文件。
2. 打开布局窗口。
3. 将所有样本拖放到布局窗口中。
4. 设门活细胞。
   1. 首先双击 vehicle-only 控件的示例数据以打开其数据窗口。
   2. 将数据可视化为紫色通道直方图。根据 CV450 比死细胞更亮的荧光来识别经 CV450 染色的活细胞。
   3. 使用单门直方图工具绘制门，以仅包含活细胞。将门命名为 viable。
   4. 然后，从样品布局窗口中，将可行的门拖动到其他细胞样品上，以均匀地应用门。
   5. 在布局窗口中，将所有样品可视化为紫色通道（活力）直方图。在继续之前，验证活细胞门控是否适合在样品中进行;如果没有，请根据需要进行调整。
      注意: 活力染色在不同处理中可能表现出差异。
5. 门衰老细胞。
   1. 双击仅车辆控件的门控活细胞数据以打开其数据窗口。
   将数据
   2. 可视化为远红通道 （DDAOG） 与绿色通道 （AF） 的点图。
   3. 使用矩形门控工具绘制一个门，以包括 <5% 的 DDAOG+ 和 AF+（右上象限）单元格。将门命名为 senescent。
   4. 然后，从样品布局窗口中，将衰老门拖动到其他细胞样品的活子集上，以均匀地应用门。
   5. 将 Section 4.4 中选通的所有可行单元格子集拖放到 layout 窗口中。将所有活样品可视化为远红外（例如 APC-A）与绿色通道（例如 FITC-A）点图。
   6. 确保在步骤 4.5.3 中绘制的衰老门在所有图上都可见，并且仅载体对照的门显示 ≤5%-10% 的衰老细胞。
6. 使用上述步骤确定衰老细胞的百分比后，使用 FlowJo 图呈现结果数据，汇总在数据表中，和/或使用标准软件进行统计分析。

材料