基于流式细胞术的治疗诱导癌细胞衰老定量分析

摘要

来源：Flor, A.，等。用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞的远红荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针。 J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于通过双衰老标志物定量治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测与定量涉及使用β-半乳糖苷酶底物。该底物被衰老细胞内活跃的溶酶体β-半乳糖苷酶切割，产生荧光产物，结合自发荧光的脂褐素颗粒，共同标记衰老的癌细胞。

方案

1. 通过化疗药物在培养的癌细胞中诱导衰老

注意：本节中的所有细胞操作步骤均应在生物安全柜中采用无菌操作技术进行。本节内容适用于贴壁细胞类型。悬浮细胞可在进行适当调整后使用，具体修改已在文中注明。

1. 根据提供特定癌细胞系的供应商或实验室的标准操作规程培养癌细胞系。
   注意： 低传代细胞（p < 10）通常更优选，因为未处理的细胞样本中复制性衰老水平较低，即背景信号较低。
2. 在药物诱导衰老前一天，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（或按推荐浓度）消化收集细胞。加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至无菌锥形管中。
   注意： 悬浮细胞无需此步骤。
3. 使用标准血细胞计数板法计数细胞，并记录细胞数/mL。以1 × 10⁶个细胞/mL的密度接种细胞。³-10 × 10³ 细胞/厘米²² 在标准的6孔塑料培养皿中。
   注意： 最佳接种密度取决于细胞的增殖速率，需由使用者自行确定。处理时（即接种后培养18–24小时）细胞应处于对数生长期，汇合度约为10%–20%。悬浮细胞的起始密度（细胞数/mL）应由使用者自行确定。六孔板每孔通常可获得足够用于一次标准流式细胞术分析的衰老细胞数量。若需进行流式分选，应使用更大的表面积（例如多个P150培养皿），以确保获得足够数量的衰老细胞用于后续实验（≥1 × 10⁶）。⁶).
4. 将接种的细胞在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜（18–24 h）₂ 以及一个湿度托盘。
5. 用诱导衰老的化疗药物处理已接种的细胞。每种药物至少设置一个阳性对照，例如依托泊苷（ETO）或博来霉素（BLM）。每种药物处理设置复孔。另设一组仅使用溶剂处理作为对照。
   注意： 用户应针对每种实验试剂进行剂量曲线测试，以确定在所用细胞系中诱导衰老的最佳浓度。
6. 在37 °C、5% CO₂培养箱中培养细胞4天₂ 并使用湿度盘以促进衰老的开始。每天在光学显微镜下观察预期的形态学变化。
   注意： 培养时间在3至5天之间可能是可接受的，具体取决于衰老启动的速度。可根据需要更换培养基并重新添加（或不添加）诱导剂，以在实现足够比例的衰老细胞的同时，维持良好的生长条件。
7. 细胞进入衰老期后，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育5分钟以收获细胞。待细胞解离成悬液后，加入等体积完全培养基中和胰蛋白酶。
   注意： 悬浮生长的细胞无需此步骤。如果要进行表面标志物染色，应避免使用胰蛋白酶-EDTA，因为它可能暂时破坏细胞表面抗原。相反，应使用无菌塑料细胞刮棒（或专为保护表面抗原设计的其他解离试剂）轻柔地解离单层细胞。
8. 使用血细胞计数板对每个样本的细胞进行计数。计算每个样本的细胞浓度（个/mL）。
   注意： 此时可加入台盼蓝以评估死亡细胞百分比（例如，因药物处理所致），但在 DDAOG 染色流程中，还将使用荧光活力染料测定细胞死亡情况。
9. 分装 ≥0.5 × 10⁶ 每份样品的细胞加入1.7 mL微量离心管中。
   注意： 每个样本的细胞数量应在所有样本间保持一致。
10. 将试管在1,000 × g条件下离心5分钟 g 在4 °C下以微量离心机离心。弃去上清液。
    注意： 若无冷藏微量离心机，对于某些耐受性较强的细胞类型，可在室温下进行离心操作。
11. 进入第2节进行DDAOG染色。

2. 细胞样品中SA-β-Gal的DDAOG染色

1. 将1 mM Bafilomycin A1储存液按1:1,000比例稀释至DMEM培养基（不含FBS）中，终浓度为1 µM。
2. 向细胞沉淀样品（来自步骤1.11）中加入配制好的Baf-DMEM溶液，使细胞浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：例如，若每份样品使用0.5 × 10⁶ 个细胞，则加入0.5 mL Baf-DMEM。
3. 在37 °C条件下（无CO₂）于旋转仪/摇床上以低速孵育30分钟。
   注意：染色过程中避免使用CO₂培养箱，因其可能导致溶液酸化，从而干扰Baf和DDAOG染色。
4. 无需洗涤，直接向每份样品中加入DDAOG储存液（5 mg/mL），按1:500稀释（终浓度为10 µg/mL）。用移液器混匀后，置于37 °C旋转仪/摇床上继续孵育60分钟（无CO₂），并避免直接光照。
5. 在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，弃去上清液。
6. 每管加入1 mL预冷的含0.5% BSA的溶液，用移液器混匀。在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤两次，以充分洗涤细胞。弃去上清液后继续后续操作。
   注意：步骤2.6中的洗涤步骤至关重要，可去除未被切割的DDAOG，避免其产生非特异性荧光发射（460/610 nm）。
7. （可选）DDAOG染色细胞的固定与保存，用于后续分析
   1. 向每份洗涤后的样品中逐滴加入0.5 mL预冷的4%多聚甲醛溶液，用移液器混匀。
   2. 室温孵育10分钟。
   3. 用1 mL PBS洗涤细胞两次。
   4. 样品可在4 °C保存最多1周，之后进行流式细胞术分析。
      注意：对于已固定的样品，请跳过步骤2.8。
8. 将Calcein Violet 450 AM储存液（1 mM）按1:1,000比例稀释至1% BSA-PBS中（终浓度为1 µM）。向步骤2.6所得洗涤后细胞沉淀中加入300 µL（适用于培养细胞样品），在冰上避光孵育15分钟。
9. 进行流式细胞术仪器设置（第3节）。

3. 流式细胞仪设置与数据采集

1. 将细胞样品转移至适用于流式细胞仪的试管中。将试管置于冰上，并避光保存。
   注意： 如果在细胞悬液中观察到团块，分析前需将悬液通过70–100 µm细胞筛；请勿使用40 µm细胞筛，因其可能滤除部分较大的衰老细胞。
2. 在所引用的软件中（参见 材料表)，打开以下图示：1）FSC-A 对 SSC-A 散点图，2）紫色通道直方图，3）远红通道（如 APC-A）对绿色通道（如 FITC-A）散点图。
   注意： 双联体排除图和单通道直方图也可使用，但并非严格必需。
3. 启动流式细胞仪数据采集。
   1. 将仅含载体的DDAOG染色对照样品置于进样口。以低进样速度开始采集样品数据。
   2. 调节FSC和SSC电压，使 >90% 的事件位于图中。若细胞在图中显示不理想，可将面积缩放设置调低至 0.33–0.5 单位。
   3. 移除仅含溶剂的样本，且不记录数据。
   4. （可选）向含有 1 mL PBS 的流式管中加入一滴彩虹校准微球。将流式管置于流式细胞仪的进样口。开始采集样本数据。
   5. 调节紫色、绿色和远红通道的电压，使彩虹微球的最高峰在每个通道中的相对荧光强度位于104–105单位范围内，且各通道中所有峰均清晰分离。记录10,000个事件。取出试管。
4. 将阳性对照样本（例如 BLM、ETO）置于进样口，该样本已用 DDAOG 染色。以低速采集样本数据。在 FSC、SSC、紫色、绿色和远红通道中观察事件，确保超过 90% 的事件位于所有图谱范围内。观察相对于仅载体对照，AF 和 DDAOG 信号是否增加。
5. 如果使用分选流式细胞仪，从本步骤开始进行分选。
   1. 为便于记录，对对照样本和每个分选样本均记录 10,000 个细胞。
   2. 分选所需数量的细胞（≥1 × 10⁶ 通常适用）转移至含有 3–5 mL 培养基的适合仪器的收集管中。
   3. 分选完成后，进行后续的培养或分析。
      注意： 对于本研究中使用的经校准流式细胞仪，最佳通道电压通常介于250至600之间（中等范围），但不同仪器的最佳电压及通道电压范围会有所差异。应避免使用过低或过高的电压，以免抑制信号或放大噪声。
6. 完成步骤 3.1–3.5 并根据需要调整流式细胞仪设置后，记录所有样品的数据。确保所有样品记录过程中设置保持一致。每份培养细胞样品至少记录 10,000 个事件。
   注意： 尽管门控和分析可使用数据采集软件（例如 FACSDiva）完成，但本文第4节将描述在数据采集后使用独立分析软件（FlowJo）进行完整的门控与分析工作流程。优先选择采集后分析，以减少细胞仪工作站上的操作时间，并充分利用专用分析软件中提供的附加工具。
7. 将样本数据保存为 .fcs 文件格式。将文件导出至配备流式细胞术分析软件（例如 FlowJo）的工作站计算机。

4. 流式细胞术数据分析

注意：本工作流程使用 FlowJo 软件。如果其他流式细胞术数据分析软件能够遵循本节所述的关键步骤，也可采用替代软件。

1. 使用 FlowJo 软件打开步骤 3.7 中的 .fcs 数据文件。
2. 打开布局窗口。
3. 将所有样本拖放到布局窗口中。
4. 圈选活细胞。
   1. 首先双击仅溶剂对照组的样本数据，以打开其数据窗口。
   2. 将数据以紫光通道直方图形式显示。根据 CV450 染色后活细胞的荧光强度高于死细胞的特征，识别活细胞。
   3. 使用单门直方图工具绘制门控区域，仅包含活细胞，并将该门命名为“viable”（活细胞）。
   4. 然后，从样本布局窗口中将“viable”门拖动到其他细胞样本上，以统一应用该门控。
   5. 在布局窗口中，将所有样本以紫光通道（活力）直方图形式显示。在继续操作前，确认各样本的活细胞门控设置恰当；若不恰当，需进行相应调整。
      注意：不同处理组之间的活力染色可能存在差异。
5. 圈选衰老细胞。
   1. 双击仅溶剂对照组中已圈选的活细胞数据，以打开其数据窗口。
   2. 将数据以远红通道（DDAOG）对绿通道（AF）的散点图形式显示。
   3. 使用矩形门控工具绘制门控区域，包含 <5% 的 DDAOG+ 和 AF+ 细胞（右上象限）。将该门命名为“senescent”（衰老细胞）。
   4. 然后，从样本布局窗口中将“senescent”门拖动到其他细胞样本的活细胞子集中，以统一应用该门控。
   5. 将第 4.4 节中已圈选的所有活细胞子集拖放到布局窗口中。将所有活细胞样本以远红通道（例如 APC-A）对绿通道（例如 FITC-A）的散点图形式显示。
   6. 确保步骤 4.5.3 中绘制的衰老细胞门在所有图中均可见，并确认仅溶剂对照组的衰老细胞比例为 ≤5%-10%。
6. 在使用上述步骤确定衰老细胞百分比后，可使用 FlowJo 图表展示结果数据，并以数据表格形式汇总，和/或使用标准软件进行统计分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴佛洛霉素 A1	Research Products International	B40500
博来霉素硫酸盐	Cayman	13877
牛血清白蛋白 (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM 活性染料	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 抗体，PE 偶联物	Biolegend	137803	克隆 H194-112
细胞系：A549 人肺腺癌细胞	American Type Culture Collection	CCL-185
细胞系：B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞	American Type Culture Collection	CRL-6475
细胞刮刀	Corning	3008
细胞筛网，100 µm	Falcon	352360
DDAO-半乳糖苷	Life Technologies	D6488
DMEM 培养基 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNase I	Sigma	DN25
多柔比星盐酸盐注射液 (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
聚乙二醇化脂质体多柔比星 (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
依托泊苷	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc 受体阻断试剂	Biolegend	101320	抗小鼠 CD16/32
流式细胞仪（细胞分析仪）	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
流式细胞仪（细胞分选仪）	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
多聚甲醛 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
青霉素/链霉素 100x	Life Technologies	15140122
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS（不含钙和镁）
Rainbow 校准微粒，超套装	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm，2E6/mL
RPMI-1640 培养基 1x	Life Technologies	11875-119
氯化钠 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
流式细胞仪数据采集软件，"FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	联系 BD 获取许可证
流式细胞仪数据分析软件，"FlowJo"	TreeStar	n/a	联系 TreeStar 获取许可证
胰蛋白酶-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114