1. 试剂的准备
- 含胆盐培养基：配制含0.4%胆盐（质量/体积）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），即将200 mg胆盐悬浮于50 mL已高压灭菌的TSB中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。每周新鲜配制。
注意事项：常规使用的胆盐为从绵羊和牛胆囊中提取的牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠按1:1比例组成的混合物。如先前研究所示，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。TSB相对于LB（Luria-Bertani）肉汤含有额外添加的葡萄糖，因此足以诱导所分析的 Shigella 及其他肠道病原菌的生物膜形成。根据待分析细菌的不同，可能需要不同的葡萄糖浓度或其他糖类需求。
- 0.5% w/v水溶液结晶紫：将2.5 g结晶紫溶解于500 mL蒸馏水中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。
2. 细菌的制备
- 用无菌培养管，取单个分离良好的菌落接种 3 mL TSB 培养基，培养待测细菌菌株过夜。在 37 °C、225 rpm 振荡条件下培养过夜（16 - 24 h）。
注意：菌株应每隔 2 至 4 周从冻存菌种重新划线分离，并保持培养皿上的菌种不超过 2 周。
3. 固相黏附实验
注意：本实验采用96孔板法对黏附细菌进行定量。细菌在平底板中静置培养。通过洗涤去除非黏附细菌后，使用结晶紫对黏附细菌进行染色。结晶紫可结合细菌细胞壁中的肽聚糖，并可用乙醇溶解。根据结晶紫的保留量来确定黏附细菌的数量。
- 准备两个 1.5 mL 离心管，分别标记为 TSB 或 TSB + 胆盐（BS）。
- 向对应的离心管中加入 1 mL 的 TSB 或 TSB + BS。
- 每管接种 20 µL 过夜培养物（按 1:50 稀释）。
- 在无菌、透明、平底、经组织培养处理的 96 孔板中，向三个孔中每孔加入 130 µL 未接种的对照培养基，作为空白对照。每种待测培养基（TSB 和 TSB + BS）均需设置三个对照孔。
- 向三个孔中每孔加入 130 µL 接种后的培养物，并重复操作，直至所有实验条件均以三复孔形式加样完毕。
- 于 37 °C 静置培养 4–24 小时。
- 使用酶标仪测定 OD600，将对照孔设为“空白”。 确认对照培养基澄清，无浑浊迹象。若发现任何浑浊，应弃去该次实验。若不同细菌菌株的生长速率存在显著差异，可利用 OD600 值对数据进行归一化处理。
- 使用真空泵轻轻倾斜培养板，从孔的下边缘缓慢抽吸去除培养基，确保完全移除所有培养液，同时不破坏附着在塑料表面的细菌群体。若在培养期间产生了胞外多糖（EPS）基质，则可见白色沉淀物。请勿扰动 EPS 基质。
- 用 200 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤各孔一次，随后使用真空泵去除 PBS 洗涤液。
- 将培养板倒置晾干，至少干燥 20 分钟。
注意：由于生物膜必须在染色前彻底干燥，因此可在本步骤暂停实验数小时甚至过夜。额外的干燥时间不会影响染色过程，但干燥不完全将影响结果的定量准确性与可重复性。
- 向每个实验孔和对照孔中加入 150 µL 0.5% 结晶紫溶液。
- 室温（RT）孵育 5 分钟。
- 用 400 µL 蒸馏水洗涤各孔一次。增加的体积有助于去除孔壁残留的结晶紫染料。使用真空泵去除洗涤液。
- 用 200 µL 蒸馏水洗涤各孔五次，每次均使用真空泵去除洗涤液。
注意：充分洗涤对定量至关重要。当空白孔经蒸馏水洗涤后完全无色、无残留结晶紫染料时，方可进行下一步。
- 将培养板倒置，避光晾干。确保如上所述完全干燥。
- 每孔加入 200 µL 95% 乙醇进行脱色。将培养板置于摇床上孵育 30 分钟。为避免蒸发，尤其是在较高温度下，建议在 4 °C 条件下进行此步骤。
- 使用酶标仪测定 540 nm 处的光密度（OD540）。
注意：结晶紫的最大吸收波长接近 590 nm。文献报道其吸收峰范围为 OD540 至 OD595 ，因此可根据所用酶标仪的可用波长选择合适的检测波长。