一种通过胞外多糖基质检测研究胆盐诱导生物膜形成的实验方法

摘要

来源：Nickerson, K. P., 等 肠道病原体中胆盐诱导的生物膜形成：鉴定与定量技术。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种基于荧光的方法，用于定量胆盐诱导的生物膜形成。在致病性肠道细菌培养物中加入胆盐后，利用一种可结合生物膜胞外多糖基质（EPS）中多糖的荧光凝集素来检测生物膜的产生。

方案

1. 试剂的准备

1. 含胆盐（BS）培养基：配制含0.4%（质量/体积）胆盐的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），将200 mg胆盐悬浮于50 mL已灭菌的TSB中。使用0.22 µm滤器过滤除菌。每周新鲜配制。
   注：常规使用的胆盐为从绵羊和牛胆囊中提取的牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠按1:1比例组成的混合物。如先前研究所示，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。TSB相较于LB肉汤含有额外添加的葡萄糖，因此足以诱导 Shigella 及其他被分析的肠道病原菌形成生物膜。根据待分析细菌的不同，可能需要不同的葡萄糖浓度或其他糖类需求。
2. 水中0.5%（质量/体积）结晶紫溶液：将2.5 g结晶紫溶解于500 mL蒸馏水中。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
3. 荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的刀豆蛋白A（ConA）：用1×PBS溶解冻存品。将10 mg浓缩原液与400 μL 1×PBS混合，稀释至终浓度为25 µg/mL，并避光保存。
4. PBS + 葡萄糖：将0.2 g葡萄糖溶解于10 mL 1×PBS中（终浓度为2% 质量/体积葡萄糖）。使用0.22 µm滤器过滤除菌。当日现配现用。
5. PBS + 胆盐：将40 mg胆盐溶解于10 mL 1×PBS中（终浓度为0.4% 质量/体积胆盐）。使用0.22 µm滤器过滤除菌。当日现配现用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
刀豆蛋白A-FITC	Sigma	C7642-10mg
葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
胆盐	Sigma	B8756-100G
LB 琼脂	Sigma	L7533-1KG
14 mL 培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌	Fisher	14-959-11B
含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂（硬封片）	Vector Laboratories	H-1500
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635-500
戊二醛	Sigma-Aldrich	G6257
平底 96 孔板（透明）	TPP	92696
平底 96 孔板（黑色）	Greiner Bio-One	655076
平底 24 孔板（透明）	TPP	92424
96 孔板读板仪	Spectramax
荧光酶标仪	Biotek Synergy 2
共聚焦或荧光显微镜	Nikon A1 共聚焦显微镜
37°C 摇床培养箱	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C 板式培养箱	Thermolyne Series 5000