一种通过胞外多糖基质检测研究胆盐诱导生物膜形成的实验方法

摘要

来源：Nickerson, K. P., 等 肠道病原体中胆盐诱导的生物膜形成：鉴定与定量技术。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种基于荧光的方法，用于定量胆盐诱导的生物膜形成。在致病性肠道细菌培养物中加入胆盐后，利用一种可结合生物膜胞外多糖基质（EPS）中多糖的荧光凝集素来检测生物膜的产生。

方案

1. 试剂的准备

1. 含胆盐（BS）培养基：配制含0.4%（质量/体积）胆盐的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），将200 mg胆盐悬浮于50 mL已灭菌的TSB中。使用0.22 µm滤器过滤除菌。每周新鲜配制。
   注：常规使用的胆盐为从绵羊和牛胆囊中提取的牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠按1:1比例组成的混合物。如先前研究所示，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。TSB相较于LB肉汤含有额外添加的葡萄糖，因此足以诱导 Shigella 及其他被分析的肠道病原菌形成生物膜。根据待分析细菌的不同，可能需要不同的葡萄糖浓度或其他糖类需求。
2. 水中0.5%（质量/体积）结晶紫溶液：将2.5 g结晶紫溶解于500 mL蒸馏水中。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
3. 荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的刀豆蛋白A（ConA）：用1×PBS溶解冻存品。将10 mg浓缩原液与400 μL 1×PBS混合，稀释至终浓度为25 µg/mL，并避光保存。
4. PBS + 葡萄糖：将0.2 g葡萄糖溶解于10 mL 1×PBS中（终浓度为2% 质量/体积葡萄糖）。使用0.22 µm滤器过滤除菌。当日现配现用。
5. PBS + 胆盐：将40 mg胆盐溶解于10 mL 1×PBS中（终浓度为0.4% 质量/体积胆盐）。使用0.22 µm滤器过滤除菌。当日现配现用。
6. PBS + 葡萄糖和胆盐：将40 mg胆盐和0.2 g葡萄糖溶解于10 mL 1×PBS中（终浓度为0.4% 质量/体积胆盐和2% 质量/体积葡萄糖）。使用0.22 µm滤器过滤除菌。当日现配现用。
7. 制备LB琼脂平板。
8. 甲醛/戊二醛固定液：向14 mL 1×PBS中加入810 µL甲醛（37%原液，终浓度3%）和125 µL戊二醛（25%原液，终浓度0.25%）。充分混匀后置于4 °C保存。使用前应确保固定液处于低温状态。
   注意：该固定液具有毒性，需按危险废物处理。
9. 抗荧光淬灭封片剂溶液：使用含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料的抗荧光淬灭封片剂溶液，以抑制免疫荧光显微镜样品的光漂白，同时对细菌DNA进行荧光染色。

2. 细菌的制备

1. 取待测细菌菌株的单个分离良好的菌落，接种于3 mL TSB培养基中，在无菌培养管内37 °C、225 rpm振荡培养过夜（16 - 24 h），制备过夜培养物。
   注意：菌株应每隔2至4周从冷冻保藏物中重新划线接种，平板培养物保存时间不得超过两周。

3. 胞外多糖基质检测

注意：这些补充性检测可对胞外多糖（EPS）进行定量和可视化。在这两种方法中，均使用凝集素来结合多糖以检测EPS。荧光标记的蛋白质可用于定量分析。

1. 胞外多糖（EPS）的半定量检测
   1. 准备两个1.5 mL离心管，分别标记为TSB或TSB + BS。
   2. 向对应的离心管中各加入1 mL的TSB或TSB + BS培养基。
   3. 每管接种20 µL过夜培养物（1:50稀释）。
   4. 在无菌的黑色平底、组织培养处理的96孔板中，向三个孔中每孔加入130 µL未接种的对照培养基，作为空白对照。每种待测培养基类型均需设置三个对照孔。向其余孔中每孔加入130 µL已接种的培养物，重复操作直至所有实验条件均以三复孔形式加样完毕。
   5. 在37 °C静置培养4–24小时。
   6. 使用移液器（理想情况下为多通道移液器）将培养基转移至透明96孔板中。注意收集全部培养基，避免扰动附着的菌体或附着在塑料表面的EPS。将转移后的样品暂置备用。
   7. 使用200 µL/孔的甲醛/戊二醛（溶于1×PBS）在室温下固定黑色96孔板，固定时间为15分钟。
   8. 在附着菌体固定的同时，对步骤1.1.6中获得的上清液组分进行检测。使用酶标仪测定OD₆₀₀，将对照孔设为“空白”。确认对照培养基澄清，无浑浊现象。若发现任何浑浊，应弃用该次实验。
      1. 也可选择在黑色底、透明底的96孔板中完成整个实验。在此情况下，可先测定OD₆₀₀值，随后弃去培养基，再进入步骤3.1.7。若不同细菌菌株的生长速率存在显著差异，可用OD₆₀₀值对数据进行归一化处理。
   9. 移除固定液，并按有害废弃物处理。
   10. 用200 µL/孔的无菌PBS轻柔洗涤孔板两次。通过真空抽滤系统，在倾斜板子的同时，缓慢从孔的下边缘抽吸洗涤液，以去除PBS。
   11. 每孔加入150 µL浓度为25 µg/mL的ConA-FITC，室温孵育15分钟。
   12. 用200 µL PBS轻柔洗涤两次。
   13. 向每孔加入150 µL PBS，记录488 nm处的荧光值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
刀豆蛋白A-FITC	Sigma	C7642-10mg
葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
胆盐	Sigma	B8756-100G
LB 琼脂	Sigma	L7533-1KG
14 mL 培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌	Fisher	14-959-11B
含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂（硬封片）	Vector Laboratories	H-1500
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635-500
戊二醛	Sigma-Aldrich	G6257
平底 96 孔板（透明）	TPP	92696
平底 96 孔板（黑色）	Greiner Bio-One	655076
平底 24 孔板（透明）	TPP	92424
96 孔板读板仪	Spectramax
荧光酶标仪	Biotek Synergy 2
共聚焦或荧光显微镜	Nikon A1 共聚焦显微镜
37°C 摇床培养箱	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C 板式培养箱	Thermolyne Series 5000