通过分散实验检测生物膜解体

摘要

来源：Nickerson, K. P. 等，肠道病原体中胆盐诱导的生物膜形成：鉴定与定量技术 J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了一种使用多孔板进行的生物膜分散实验。缓冲液和葡萄糖处理可拆解生物膜，释放出细菌；而胆盐则诱导应激反应，使细菌保留在具有保护作用的胞外聚合物基质中。通过菌落形成单位测定，可评估生物膜的分散程度，缓冲液和葡萄糖处理组的分散率更高，表明生物膜成功解体。

方案

1. 试剂的制备

1. 含胆盐培养基：配制含0.4%胆盐（质量/体积）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），将200 mg胆盐悬浮于50 mL已高压灭菌的TSB中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。每周新鲜配制。
   注意事项：常规使用的胆盐为从绵羊和牛胆囊中提取的牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠1:1混合物。如先前研究所示，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。TSB中的葡萄糖含量高于LB肉汤（Luria-Bertani肉汤），因此足以诱导所分析的 Shigella 及其他肠道病原菌的生物膜形成。根据待分析细菌的不同，可能需要不同的葡萄糖浓度或其他糖类需求。
2. 0.5%（质量/体积）结晶紫水溶液：将2.5 g结晶紫溶解于500 mL蒸馏水中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。
3. 磷酸盐缓冲液（PBS）+ 葡萄糖：将0.2 g葡萄糖溶解于10 mL 1× PBS中（终浓度为2% 质量/体积葡萄糖），使用0.22 µm滤膜过滤除菌。当日现配现用。
4. PBS + 胆盐：将40 mg胆盐溶解于10 mL 1× PBS中（终浓度为0.4% 质量/体积胆盐），使用0.22 µm滤膜过滤除菌。当日现配现用。
5. PBS + 葡萄糖和胆盐：将40 mg胆盐和0.2 g葡萄糖溶解于10 mL 1× PBS中（终浓度为0.4% 质量/体积胆盐和2% 质量/体积葡萄糖），使用0.22 µm滤膜过滤除菌。当日现配现用。
6. 制备LB琼脂平板。

2. 细菌的制备

1. 取待测细菌菌株的单个分离良好的菌落，接种于3 mL TSB培养基中，在无菌培养管内37 °C、225 rpm振荡培养过夜（16 - 24 h），制备过夜培养物。      
   注意：菌株应每隔2至4周从冻存菌种重新划线接种，平板培养物保存时间不得超过两周。

3. 分散实验

注意：本实验用于检测细菌分散导致的生物膜解体。具体操作为：先形成成熟的生物膜，随后（通常在次日）将培养基更换为 PBS 或添加的 PBS。然后检测上清液组分，以定量从生物膜中解离出的细菌数量。

1. 准备两个 1.5 mL 离心管，分别标记为 TSB 或 TSB + BS（胆盐）。
2. 向对应的离心管中加入 1 mL 的 TSB 或 TSB + BS。
3. 每管接种 20 µL 过夜培养物（按 1:50 稀释）。
4. 在无菌、透明、平底、经组织培养处理的 96 孔板中，向三个孔中每孔加入 130 µL 未接种的对照培养基，作为空白对照。每种待测培养基均需设置三个对照孔。
5. 向三个孔中每孔加入 130 µL 接种后的培养物，并重复操作，直至所有实验条件均以三复孔形式加样完毕。
6. 将 96 孔板在 37 °C 静置培养 4–24 小时。
7. 继续操作前，将 PBS、PBS + 葡萄糖、PBS + 胆盐以及 PBS + 胆盐 + 葡萄糖预热至 37 °C。上述试剂需每日新鲜配制。
8. 使用酶标仪测定光密度 OD₆₀₀，将对照孔设为“空白”。 确认培养基澄清，无浑浊现象。若发现任何浑浊，应弃去该次实验。若不同菌株间生长速率存在显著差异，可利用 OD₆₀₀ 值对数据进行归一化处理。
9. 使用真空泵移除培养基，注意完全收集培养基，同时避免破坏附着在塑料表面的菌体。
10. 用 200 µL/孔的无菌 PBS 轻柔洗涤孔板两次，每次洗涤后使用真空泵吸除 PBS。
11. 向每组三个孔中分别更换以下预热至 37 °C 的试剂，每孔 130 µL：PBS、PBS + 葡萄糖、PBS + 胆盐、PBS + 胆盐 + 葡萄糖。
12. 将 96 孔板在 37 °C 培养 30 分钟。
13. 小心地从 37 °C 培养箱中取出 96 孔板，将上清液转移至新的无菌 96 孔板中。
14. 使用 96 孔板或稀释板，将上清液用无菌 PBS 进行 10 倍（1:10）系列稀释。
    注意：稀释梯度应根据待测菌株的不同，从原液至 10^-6 不等。可通过预实验确定最佳稀释范围。
15. 使用多通道移液器，将每个稀释度的 5 µL 点样至 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。次日计数菌落，并根据稀释倍数计算回收菌落形成单位（CFU）。为计算相对于 1× PBS 对照组（设为 100%）的分散百分比，将各处理组的回收 CFU 除以 1× PBS 对照组的回收 CFU。
    注意：也可使用目标菌株常规培养的平板。例如， Shigella 可点样于刚果红平板上。确保平板干燥，以保证点样操作的准确性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
胆盐	Sigma	B8756-100G
LB 琼脂	Sigma	L7533-1KG
14 mL 培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌	Fisher	14-959-11B
平底 96 孔板（透明）	TPP	92696
96 孔板读板仪	Spectramax
荧光读板仪	Biotek Synergy 2
37°C 摇床培养箱	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C 板式培养箱	Thermolyne Series 5000