一种用于制备样本以观察菌丝上生物膜形成细菌的方法

摘要

来源：Guennoc, Cora Miquel, 等，利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了一种利用显微镜培养并定性分析真菌菌丝上细菌生物膜的方法。细菌生物膜常在真菌表面形成，涉及多种细菌与真菌的相互作用过程，例如代谢协作、竞争或捕食。

方案

1. 一种的制备 体外 真菌菌落上的细菌生物膜

1. 将细菌培养物在5,000 × g离心3分钟，用25 ml无菌0.1 M磷酸钾缓冲液（25 g/L KH₂PO₄ 和 2.78 g/L K₂HPO₄，pH 5.8）重悬沉淀。重复此步骤一次，并用相同缓冲液将最终细菌浓度调整至10⁹ 个细胞/ml。
2. 向6孔微孔板中每孔加入5 ml细菌悬液（阴性对照孔加入无菌0.1 M磷酸钾缓冲液）。
3. 用无菌剃刀片切割真菌培养物上的玻璃纸膜，获得每片上含有单个真菌菌落的玻璃纸方块。用镊子小心地从固体培养基上取下带有菌丝的玻璃纸方块，并将其转移至含有细菌悬液的微孔板孔中。
4. 在真菌菌落仍附着于玻璃纸时轻轻振荡微孔板；随后移除玻璃纸片，使真菌菌落留在板中。
5. 将微孔板在适合所研究微生物生长的温度下，以轻度振荡（约60 rpm）培养。
   注意： 培养时间取决于生物膜形成的速度以及待分析的发育阶段。对于P. fluorescens BBc6/L. bicolor，于20 °C培养30分钟可获得早期生物膜，培养长达16小时可获得成熟生物膜。

2. 生物膜形成的激光扫描共聚焦显微镜分析

1. 样品制备
   1. 为去除浮游细菌及通过静电作用附着在菌丝上的细菌，将真菌转移至一个新的6孔微孔板中，该微孔板内含5 ml高浓度盐溶液（NaCl，17 g/L），轻轻振荡1分钟。
   2. 将真菌转移至另一个含有5 ml无菌0.1 M磷酸钾缓冲液的6孔微孔板中，轻轻振荡2分钟，随后将真菌转移至新鲜的磷酸钾缓冲液中。
   3. 用解剖刀在保持于磷酸钾缓冲液中的同时，切割出拟用于成像的菌落部分，使所得片段包含约一半的真菌菌落。
   4. 为对样品进行染色，将其转移至一个含有无菌水并添加了适当荧光染料（根据分析目的选择）的培养皿中，并在避光条件下孵育。
      1. 为观察真菌网络结构，可使用刚果红（终浓度0.1%，孵育5分钟）、与Alexa Fluor 633偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）（终浓度10 µg/ml，孵育10分钟）或FUN1（终浓度10 µM，孵育10分钟）。
      2. 若使用未标记荧光的细菌，可选用多种市售的细胞通透性DNA荧光探针之一对细菌细胞进行复染，例如DAPI（终浓度0.25 µg/ml，孵育10分钟）。
      3. 为观察基质蛋白，使用蛋白染色剂。
   5. 染色后，将样品转移至含有10 ml无菌0.1 M磷酸钾缓冲液的培养皿盖中进行清洗，轻轻振荡1分钟。
   6. 将载玻片半浸入培养皿盖内的缓冲液中，小心地使切割后的样品漂浮于载玻片上方；然后缓慢将载玻片从缓冲液中取出，使样品轻柔地沉降在载玻片上。
      注意：此步骤操作必须轻柔，以避免生物膜结构受到扰动。
   7. 最后，在样品上加入10 μl抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。
      注意：载玻片制备完成后，必须尽快进行显微观察（最迟不超过30分钟），以避免生物膜结构发生改变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔 Falcon 组织培养板	Fisher Scientific	08-772-33	用于 2.2 & 3.1
刚果红	Fisher Scientific	C580-25	用于 3.1.4.1
FUN 1 细胞染色剂	赛默飞世尔科技	F7030	用于 3.1.4.1
麦芽凝集素，Alexa Fluor 633 标记物	赛默飞世尔科技	W21404	用于 3.1.4.1
DAPI溶液	赛默飞世尔科技	62248	用于 3.1.4.2
碘化丙啶	赛默飞世尔科技	P3566	用于 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby 生物膜基质蛋白染色剂	赛默飞世尔科技	F10318	用于 3.1.4.4
Fluoromount-G 封片剂	Fisher Scientific	OB100-01	用于 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		用于 3.2.1
ZEN 2.1 lite black 软件	Zeiss		用于 3.2.1
高真空镀膜仪 Leica EM ACE600	Leica		用于 4
GeminiSEM-FEG	Zeiss		用于 4