利用共聚焦显微镜实时分析不同肿瘤区域中驻留T细胞的迁移

摘要

来源：Peranzoni, Elisa, 等. 离体 使用共聚焦显微镜对人肺肿瘤组织切片中驻留性CD8 T淋巴细胞进行成像 视频实验杂志 (2017).

本视频介绍了在人类肺癌组织切片中，利用荧光标记抗体对驻留的肿瘤浸润性CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可通过共聚焦显微镜对CD8 T细胞的迁移进行实时分析。

方案

1. 组织驻留性CD8 T细胞与肿瘤细胞的免疫染色

1. 将抗体（终浓度为 10 µg/mL）和核染料（终浓度为 1 µg/mL）用不含酚红的 RPMI-1640 培养基稀释。
   注意：使用荧光标记的抗 CD8 抗体（小鼠 IgG，克隆号 SK1）和抗 EpCAM 抗体（上皮细胞黏附分子，小鼠 IgG，克隆号 HEA-125）分别标记 CD8 T 淋巴细胞和肿瘤上皮细胞。使用荧光标记的抗 CD90/Thy1 抗体（小鼠 IgG，克隆号 5E10）标记成纤维细胞和活化的内皮细胞。使用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞膜完整性受损的细胞的细胞核，以评估组织活性。
2. 从培养箱中取出培养板，使用移液器吸除不锈钢洗涤环内的所有液体。不要移除细胞培养插件下方的 1.1 mL RPMI-1640 培养基。
3. 在不接触组织切片的前提下，使用移液器枪头将 40 µL 含抗体的溶液加至每一片肿瘤组织切片上。
4. 将培养板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以完成抗体染色。
5. 使用精细镊子移除洗涤环，取出组织切片，并在不含酚红的 RPMI-1640 培养基中浸洗 10 秒。将切片放回细胞培养插件上，每片切片上滴加一滴不含酚红的 RPMI-1640 培养基。将培养板在 37 °C 下维持 10 分钟，随后进行成像分析。

2. 人肺癌组织切片中驻留性CD8 T细胞迁移的成像与分析

注意：本方案中使用的共聚焦显微镜为直立式转盘共聚焦显微镜，配备25倍水浸物镜（25×/0.95 数值孔径）。

1. 准备显微镜系统
   1. 在开始成像前数小时，将显微镜加热腔的温度设定为 37 °C。
   2. 建立一个持续灌注系统，向肿瘤切片中灌注含氧（5% CO₂，95% O₂）且不含酚红的 RPMI 培养基（图 1）。使用蠕动泵将灌注液送入成像腔，并将废液抽吸至废液收集瓶中。
   3. 启动蠕动泵，使含氧溶液流经灌注管路。
2. 用精细镊子将切片从 6 孔板中取出，转移至盛有不含酚红的 RPMI 培养基的 35 mm 塑料培养皿中。使用直径为 19.7 mm、线间距为 2 mm 的切片固定锚固定切片。将培养皿置于显微镜的成像载物台上。连接灌注系统的进液端和出液端。启动灌注系统，并将培养基流速设定为 0.8 mL/min。
3. 将水浸物镜下降至切片位置。使用明场照明对切片表面进行调焦。使用适当的荧光光源，选择一个包含 CD8 T 细胞、肿瘤细胞岛（EpCAM 阳性）和基质区域（CD90 阳性）的感兴趣区域。通过检测切片切面及组织深层的 DAPI 染色情况，评估切片内细胞的活力。
   注意：健康的切片中，仅在切面数微米范围内有少数 DAPI 阳性细胞。
4. 设置成像实验，执行以下操作。
   1. 根据三种荧光染料的荧光信号强度，将曝光时间设定在 50 至 800 ms 之间，激光强度设定在 20% 至 40% 之间。
   2. 选择用于在肿瘤切片内成像的 z 轴堆栈厚度。
      注意：此处采集了 10–12 个光学层面，z 轴总深度为 60–70 µm。
   3. 将起始位置设定在第一个标记的 CD8 T 细胞下方约 10 µm 处。
   4. 设定每次 z 轴堆栈成像之间的时间间隔为 10 至 30 秒，总记录时间为 10 至 30 分钟。

结果

图 1：灌流系统的照片。 A) 酚红-free RPMI 溶液经含 5% CO₂、95% O₂ 的气体混合物饱和。B) 溶液随后由蠕动泵进行灌流。C) RPMI 溶液通过入口进入培养皿，从出口处，泵将溶液从培养腔抽吸至废液容器中。注意：抽吸管尖端的位置用于控制溶液液面高度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直立式共聚焦显微镜	Leica	建议使用转盘共聚焦显微镜
Imaris 软件	Bitplane		该软件用于图像可视化及T细胞迁移轨迹追踪
精细镊子	World Precision Instruments	14142
30 mm 培养插件	Millipore	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基，含 GlutaMAX 补充剂	ThermoFisher	61870010	完全RPMI培养基的配制方法为添加10%热灭活胎牛血清及青霉素/链霉素
磷酸盐缓冲液 (PBS)	ThermoFisher	20012019
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)	Invitrogen	14170088
低凝胶温度琼脂糖，VII-A型	Sigma-Aldrich	A0701
无毒丁基氰基丙烯酸酯胶水，Vetbond	3M	1469
组织切片固定锚，直径19.7，螺距2 mm	Warner Instruments	64-1415
不锈钢垫圈，内径5 mm	Amazon	B004K1FDGQ
BV605标记的抗CD8抗体（克隆SK1）	BD Biosciences	565289
FITC标记的抗EpCAM抗体（克隆HEA-125）	Miltenyi Biotec	130-098-113
BV510标记的抗CD90抗体（克隆5E10）	Biolegend	328125
4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)	ThermoFisher	D1306