一种通过FRET流式细胞术检测Tau蛋白种子诱导的报告蛋白聚集的技术

摘要

来源：Furman, J. L., 等. 利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性. J. Vis. Exp. (2015)。

该视频展示了一种荧光共振能量转移（FRET）流式细胞术检测方法，用于检测从生物样本中分离出的蛋白质聚集体的“播种”活性。表达tau报告蛋白的哺乳动物细胞与含有tau种子的脂质体转导复合物共同孵育。这些种子可介导报告蛋白发生聚集，从而在流式细胞仪中产生FRET阳性信号。

方案

注意：本方案重点介绍使用FRET流式细胞术检测小鼠生物样本中的种子活性。该方法也可用于重组原纤维和人类生物样本。小鼠安乐死及脑组织采集均按照IACUC批准的操作规程进行。

1. 脑组织提取

1. 使用异氟烷（2%）进行深度麻醉后，用含0.03%肝素的冰冻PBS灌注小鼠，并按照Gage et al. 中描述的详细步骤取出脑组织。
2. 将取出的组织置于冷冻管中，通过浸入液氮进行速冻。或者，也可在干冰上冷冻组织。一旦组织完全冻结，如需长期保存，可转移至-80 °C保存。
   注意：本方案适用于全脑匀浆或显微解剖分离的脑区。有关详细的显微解剖方案，请参见Hagihara et al.。

2. 生物种子材料的制备

1. 通过将蛋白酶抑制剂（不含乙二胺四乙酸（EDTA））溶解于1×TBS（Tris缓冲盐水，每10 ml加入1片）中来制备匀浆缓冲液。充分涡旋混匀，并置于冰上保存。为保持生物传感器细胞的活力，所用蛋白酶抑制剂必须不含EDTA。
2. 将冷冻的脑组织放入一次性称量舟中称重，然后转移至5 ml锥形管中。加入预冷的匀游戏副本缓冲液，使最终溶液浓度为10%（重量/体积）。暂时置于冰上保存。组织质量及后续加入的匀浆缓冲液体积将根据脑组织大小和/或使用区域的不同而有所变化。此处，0.2 g重的成年小鼠半脑组织悬浮于2 ml缓冲液中，形成10% w/v的溶液。
3. 将样品转移至低温操作区，并调节探头式超声破碎仪至适当参数。使用Omni Ruptor超声破碎仪（如图所示）时，将功率设为20%，对应输出功率约75 W。采用脉冲模式以防止样品在超声过程中过热。将脉冲时间设为30%，对应约500毫秒。
4. 用清水、异丙醇和再次用清水依次冲洗探头尖端，并在每次冲洗之间用实验室擦拭纸擦干。务必用擦拭纸彻底清洁探头的侧面和底部。
5. 每次处理一个样品，将探头尖端浸入匀浆缓冲液中，启动超声破碎仪。按照上述设定的功率和脉冲参数，共进行25次脉冲处理。确保组织完全悬浮。此步骤中需注意避免样品产生泡沫。
   注意：若出现以下情况，样品易产生泡沫：a）总体积过小，或 b）匀浆液温度升高。使用本仪器时，样品体积不应低于250 µl。为确保样品保持低温，此步骤中可将离心管置于冰上。
6. 用擦拭纸擦去探头上残留的裂解物后，向盛有洁净水的烧杯中施加10次脉冲。然后参照步骤2.4的方法，依次用清水、异丙醇和清水再次冲洗探头的侧面和底部，每次冲洗之间均用擦拭纸擦干。为避免交叉污染，每次更换样品之间必须彻底清洗探头。
   注意：对于tau蛋白聚集体，我们尚未发现需要更严格的清洗方法来防止样品间污染。然而，其他类型的淀粉样蛋白可能需要更细致的清洗程序，相关方法已在文献中广泛描述。
7. 将匀浆液置于冰上保存，直至所有样品处理完毕。
8. 在4 °C条件下，以21,300 × g离心15分钟。
9. 小心将上清液转移至洁净离心管中，注意不要扰动沉淀。弃去沉淀。将上清液分装后，于-80 °C保存以供后续使用。但应避免匀浆液反复冻融，因其会降低种子效应效率。

3. 生物传感器细胞的重铺板

注意：本实验需使用四种细胞系：HEK 293T（细胞系 #1）、RD-P301S-CFP（细胞系 #2）、RD-P301S-YFP（细胞系 #3）和 RD-P301S-CFP/YFP（细胞系 #4）。每种细胞系在实验中的作用请参见参考表 1。

1. 在无菌环境中，吸除培养基，用预温的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，然后吸除。加入3 ml胰蛋白酶-EDTA（0.05%）消化3分钟，加入9 ml预温的完全培养基（DMEM，10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素，1% GlutaMax）终止消化，并立即将细胞转移至锥形管中。
2. 在室温下以 1,000 x g 离心细胞 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于预热的培养基中。
3. 使用血细胞计数板确定每种细胞系的细胞密度。细胞密度会因收获时的融合度和重悬体积不同而有所变化。将从融合度为90%的10 cm培养皿中收获的细胞重悬于10 ml培养基中，细胞密度约为100万细胞/ml。
4. 将细胞与培养基混合，配制成母液，使96孔板的每孔含有35,000个细胞，培养基体积为130 µl（例如，为100个孔制备主混合液时，将350万个细胞重悬于13 ml培养基中。根据具体的实验设计和时间安排调整细胞数量。若在铺板后约18小时进行细胞处理，则每孔加入35,000个细胞至96孔板中。
5. 使用多通道移液器，缓慢将130 µl主混合细胞悬液加入平底、经组织培养处理的96孔板的每个孔中。加样时，将移液器吸头置于孔中央，避免接触孔底。
   注意： 尽管可以调整铺板格式，但建议每块板中细胞系1-3各设4个孔（n = 4）。板上其余孔（n = 84）保留用于细胞系#4（生物传感器细胞）。
6. 让细胞在室温下静置10分钟，使细胞沉降。随后在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。₂，且相对湿度≥80%。

4. 处理细胞

注意：次日，当 tau 生物传感器细胞融合度达到 60–65% 时，按如下方法制备种子转导复合物：

1. 在一个离心管中，将转染试剂（如Lipofectamine）与减血清培养基（如Opti-MEM）混合，配制总混液。每孔加入1.25 µl转染试剂和8.75 µl减血清培养基。轻轻弹击离心管混匀，短暂离心，室温孵育5分钟。
2. 在另一支试管中，将种子材料（第2.9步裂解液的等分试样）与减血清培养基混合。
   注意： 种子材料的体积需根据具体实验而定。选择种子体积时，应考虑以下因素：样品中种子的丰度及其潜在的细胞毒性。粗制匀浆物可能对细胞具有毒性，因此应使用能观测到目标效应的最低体积。此前测试的裂解物体积范围为每孔1-5 µl，对应总蛋白量为5-20 µg。确保每孔总体积（种子 + 低血清培养基）为10 µl。
3. 将4.1和4.2中所述两个离心管中的内容合并，轻轻弹击混匀，短暂离心（1,000 × g，5秒），室温孵育至少20分钟，最长不超过2小时。
4. 轻轻将20 µl转导复合物沿每个生物传感器孔的孔壁加入。若可能，设置三个技术重复。将处理后的细胞放回培养箱，孵育24–48小时。孵育条件与步骤3.6中所述相同。
   注意： 该实验设置的适当阴性对照条件是用空脂质体处理的生物传感器细胞（即，脂质体试剂 + 低血清培养基），因为磷脂的应用相对于未暴露于脂质体试剂的生物传感器细胞会引起荧光谱图的轻微偏移。

5. 用于FRET流式细胞术的细胞收获

注意： 在收获细胞前——通常为处理后24–48小时——可使用标准倒置荧光显微镜的绿色荧光蛋白（GFP）滤光片对成种活性进行初步观察。未添加成种材料处理的细胞（即，空白脂质体）将显示弥散性荧光，而经种子材料处理的细胞则显示强烈的点状和网状胞内包涵体（图1A-B).

1. 使用多通道移液器吸取所有细胞培养基（150 µl）。加入胰蛋白酶（50 µl）消化细胞5分钟，然后加入150 µl预冷的培养基终止消化。此步骤中无需在胰蛋白酶消化前用PBS洗涤，以免导致细胞脱落和后续细胞丢失。在流式细胞术分析时，通过设门策略排除污染的死细胞和碎片。
2. 终止消化后立即转移细胞至96孔圆底板中，在室温下以1,000 × g离心5分钟。
3. 吸除并弃去上清液，注意避免扰动细胞沉淀。
4. 用50 µl 2%多聚甲醛轻柔但充分地重悬细胞沉淀，孵育10分钟。也可选择不固定而直接检测活细胞，但固定处理可获得更清晰且更一致的结果。
5. 在室温下以1,000 × g离心细胞5分钟，吸除并弃去多聚甲醛溶液，注意避免扰动细胞沉淀。
6. 用200 µl预冷的流式细胞术缓冲液（Hanks' 平衡盐溶液（HBSS），1% FBS，1 mM EDTA）轻柔但充分地重悬细胞沉淀，并尽快上机检测，以避免细胞聚集。

6. FRET 流式细胞术

注意：使用配备有适用于 FRET 的激光线和滤光片组的流式细胞仪，例如 MACSQuant VYB（表2）。在本节的每一步中，使用软件的96孔板模板点击目标孔位，然后点击“播放”以开始样品进样和流式检测。通过点击“新建分析窗口”图标来创建图谱或统计表格。通过点击X轴或Y轴标题并选择相应的滤光片，可更改双变量图中各轴的参数。如需调整细胞群体位置或荧光信号，可升高或降低对应滤光片相关的电压。使用该仪器时，运行速度应保持在<1,000 个事件/秒，以确保准确的单细胞监测。

1. 制作一个侧向散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）的双变量图，运行细胞系#1，调节SSC和FSC电压，使细胞群位于左下象限。点击多边形工具，圈定细胞群（门P1）。所有设门参数见图2。
2. 制作一个FSC-H（高度）与FSC-A的双变量图，通过点击该图上方的“live”并选择P1，将门P1应用于该图。运行细胞系#1，点击多边形工具，圈定单细胞群体（门P2）。
3. 制作3个直方图，分别对应感兴趣的三种滤光片：CFP、YFP和FRET。通过点击各图上方的“live”并选择P2，将门P2应用于所有这些图。运行细胞系#1，调节电压，使CFP、YFP和FRET直方图中细胞群体的中位值均位于0至1之间。测量CFP和FRET时，使用405 nm激光激发细胞，并分别用450/50 nm和525/50 nm滤光片采集荧光信号。测量YFP时，使用488 nm激光激发细胞，并用525/50 nm滤光片采集荧光信号。激光和滤光片设置详见表2。
4. 对CFP在FRET和YFP通道中的荧光溢出进行补偿。
   注意：补偿是指校正荧光溢出的过程。当一种荧光染料的发射光被检测到设计用于检测另一种荧光染料信号的滤光片捕获时，即发生荧光溢出。通过适当的补偿，可从FRET和YFP通道中去除CFP的溢出荧光信号。
   注意：补偿需要同时存在荧光阳性和阴性细胞。因此，在对CFP阳性细胞（细胞系#2）进行补偿时，必须在上机前将阴性细胞（细胞系#1）加入样本中。
   1. 在进行补偿前，立即将单孔中的30 µl细胞系#1悬液加入200 µl细胞系#2悬液中。
   2. 点击“仪器设置”图标，然后选择“补偿”选项卡，勾选“矩阵”以打开补偿矩阵表。
   3. 制作FRET-A 与 CFP-A的双变量图，并如步骤6.3所述应用门P2。运行细胞系#1和#2混合样本，点击“象限”图标，绘制象限，使荧光阴性和阳性细胞群分别位于下方两个象限（门LL3和LR3）。
   4. 创建一个统计表，显示LL3和LR3门中FRET的中位荧光强度（MFI）。调节补偿矩阵中的FRET参数，直至LL3和LR3的FRET MFI相等。完成此步骤后，未染色细胞与CFP阳性细胞的FRET MFI相同，表明CFP在FRET通道中无荧光溢出。
   5. 制作YFP-A 与 CFP-A的双变量图，并如步骤6.3所述应用门P2。绘制象限（LL4和LR4），方法与步骤6.4.3类似。
   6. 创建一个统计表，显示LL4和LR4门中YFP的MFI。调节补偿矩阵中的YFP参数，直至LL4和LR4的YFP MFI相等。完成此步骤后，未染色细胞与CFP阳性细胞的YFP MFI相同，表明CFP在YFP通道中无荧光溢出。
5. 完成设门和补偿后，选中感兴趣的孔，运行剩余的孔。
6. 所有样本运行完毕后，点击“文件”，然后点击“复制”，导出数据文件。选择“数据文件”选项卡，选中实验文件夹，点击“复制”。

结果

表1：用于FRET流式细胞术的细胞系. HEK 293T 细胞用于流式细胞术设置。CFP 单阳性细胞用于补偿（*）。YFP 单阳性细胞用于消除因 405 nm 激发直接激活 YFP 所导致的假 FRET 信号。CFP/YFP 双阳性细胞具有 FRET 兼容性，作为生物传感器细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TBS	Sigma	T5912
完全蛋白酶抑制剂（无EDTA）	Roche	4693159001
冻存管	Sarstedt	72.694.006
分析天平	Mettler Toledo	XSE 105DU
称量舟	Fisher Scientific	13-735-743
15 mL 锥形管	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor 超声波匀浆器	Omni International	18-000-115
超声波匀浆器微型探头	Omni International	OR-T-156
2-丙醇	Fisher Scientific	A451
降噪耳罩	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes 纸巾	Fisher Scientific	S47299
1.5 mL 管	USA Scientific	1615-5510
微量离心机	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
胎牛血清	HyClone	SH30071.03
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 mL 锥形管	Phenix Research	SS-PH15
25 mL 试剂储液槽	VWR	41428-954
多通道移液器	Fisher Scientific	TI13-690-049
96孔平底板	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96孔圆底板	Corning	3788
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 离心机	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner 摆动桶转子	Thermo Scientific	75003796
血细胞计数板	VWR	15170-172
MACSQuant VYB 流式细胞仪	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 样品架	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo 分析软件	Flow Jo
20 µL 移液器吸头	Rainin	GPS-L10
200 µL 移液器吸头	Rainin	GPS-250
1 mL 移液器吸头	Rainin	GPS-1000
200 µL 移液器吸头	USA Scientific	1111-1800
5 mL 移液管	Phenix Research	SPG-606180
10 mL 移液管	Phenix Research	SPG-607180
25 mL 移液管	Phenix Research	SPG-760180