一种评估毒素暴露对微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）抑制作用的技术

摘要

来源：Hubbard, K. 等.，利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络化培养物对生物神经毒素进行功能评价。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了胚胎干细胞来源的神经元在暴露于神经毒素后的电生理学分析。用肉毒神经毒素处理这些神经元可降低自发性微小兴奋性突触后电流的频率，证实了突触传递受到抑制。

方案

1. 胚胎干细胞（ESCs）向无饲养层悬浮培养的适应

1. 在37 °C下解冻ESCs，直至仅剩少量冰晶。
2. 使用P1000移液器，将1 - 2.5 × 10⁶个解离的ESCs轻柔转移至含有10 ml预热ESC培养基的非组织培养处理培养皿中。在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的湿润化组织培养孵箱中孵育20小时。
3. 孵育20小时后，使用10 ml血清移液管将悬浮培养物轻柔转移至15 ml锥形管中进行洗涤。在200 × g条件下离心3分钟以收集ESCs。离心期间，向低黏附培养皿中加入10 ml新鲜ESC培养基。
4. 吸除上清液，注意避免扰动细胞沉淀，并向细胞沉淀中加入1 ml新鲜ESC培养基。使用P1000移液器将细胞转移至细菌培养皿中，并放回孵箱继续培养。
5. 每日观察细胞，直至肉眼可见细胞聚集体（通常为4 - 8天；聚集体直径约为0.2 - 0.5 mm）。若4天后仍未见明显聚集体，重复步骤1.3。一旦观察到聚集体，按第2节所述方法对ESCs进行解离与维持培养。

2. 胚胎干细胞传代与维持

1. 使用无菌的10 ml移液管将ESC聚集体转移至15 ml锥形管中，静置使聚集体沉淀形成紧密的细胞团（通常需3 - 5分钟）。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后用5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤聚集体。建议采用重力沉降法，但也可选择在200 x g下离心2.5分钟以节省时间。
2. 吸除PBS，加入500 µl胰蛋白酶。将聚集体置于37 °C水浴中孵育3分钟。加入500 µl ESC培养基以稀释胰蛋白酶，并用P1000移液器轻柔吹打10次以分散聚集体。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
3. 在200 x g下离心3分钟，沉淀解离后的细胞，然后将细胞重悬于ESC培养基中，调整终浓度为1.0 x 10⁷ 个细胞/ml。取150 µl（含1.5 x 10⁶ 个细胞）接种至10 ml新鲜ESC培养基中，置于10 cm细菌培养皿内，放回组织培养孵箱培养48小时。多余的ESC可用于诱导分化，或以1 - 5 x 10⁶ 个细胞/ml的密度悬浮于含10%二甲基亚砜（DMSO）的90% ESC培养基中进行冷冻保存，或弃去。
4. 每48小时传代一次聚集体。适合传代的聚集体应清晰可见，直径超过0.5 mm。
   注意： 冷冻保存的悬浮适应性细胞的复苏与培养请参照步骤1.2 - 1.4进行。聚集体将在48 - 72小时内达到可传代状态。

3. 神经元分化

注意：在中午之前完成步骤 3.1 - 3.5，在中午之后完成步骤 3.7。分化流程的概览见图 1A。

1. 按照步骤2.1–2.5消化ESCs。转移350 µl（3.5 × 10⁶）细胞。⁶将解离的 ESCs 接种至含有 25 ml 分化培养基的 10 cm 低吸附培养皿中。置于组织培养孵箱内，37 °C、5% CO₂ 条件下，以 30 - 45 rpm 的转速在旋转摇床上培养₂。这是分化的第一天，称为第1天 体外 （体外培养天数）-8
   注意： 使用超低吸附培养皿会增加方法成本，但与细菌培养皿相比可获得略高的产量，因为细胞团块有时会黏附在培养皿上。若选用不同规格的培养皿，可相应调整培养基体积和细胞数量。
2. 48 小时后（DIV -6），使用 25 ml 移液管将正在分化的细胞聚集体转移至 50 ml 锥形管中。立即向培养皿中加入 25 ml 新鲜分化培养基。
3. 让聚集体静置 2 - 5 分钟，形成可见的沉淀，沉淀深度为 1 - 2 mm。悬浮液中残留的单个细胞或小聚集体可忽略。小心吸除上清液，并用 P1000 将细胞沉淀转移回培养皿中。置于组织培养孵育箱内的旋转摇床上。
4. 在 DIV -4 时，重复步骤 3.2。沉淀物深度为 2–4 mm。向培养皿中加入 30 ml 添加了 6 µM 全反式维甲酸（RA）的分化培养基。将培养皿放回组织培养孵育箱中的旋转摇床上，继续培养 48 小时。
5. 在DIV -2时，重复步骤3.3。此时沉淀物深度为4 - 8 mm。
6. 在DIV -1时，按照第4节的方法准备铺板表面。
7. 在 DIV 0 时，将 5 ml 预分装并冷冻保存的神经前体细胞（NPC）胰蛋白酶消化液于 37 °C 解冻 5–10 分钟，并置于组织培养超净台中。使用 25 ml 移液管将分化中的细胞团转移至 50 ml 锥形管中。静置使细胞团沉淀，小心吸除上清液。用 10 ml PBS 洗涤沉淀物两次，每次洗涤之间静置使细胞团充分沉淀。
8. 第二次 PBS 洗涤后，向沉淀中加入 5 ml NPC 消化培养基，在 37 °C 下孵育 5 分钟。孵育 2.5 分钟后，轻轻弹击离心管。
9. 加入5 ml 0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）以灭活胰蛋白酶，通过倒置混匀。用10 ml血清移液管轻柔吹打10–15次，直至形成相对均一的细胞悬液。
10. 将细胞悬液缓慢转移至置于50 ml锥形管顶部的40 µm或70 µm细胞筛中。待全部悬液过滤后，加入1 ml N2培养基冲洗残留细胞通过滤膜，随后在200 × g离心6 min，收集解离的细胞悬液。
11. 吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用10 ml N2培养基洗涤细胞两次，每次以200 × g离心5分钟收集细胞沉淀，每次洗涤之间用P1000移液器吹打重悬细胞。第二次洗涤前，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
12. 在 N2 培养基中重悬细胞，密度为 1 × 10⁷ 每毫升细胞数，并以每平方厘米150,000 - 200,000个细胞的密度接种胚胎干细胞来源的神经元（ESNs）².
13. 将新接种的ESNs转移至37 °C、5% CO₂的湿化组织培养孵箱中₂ 并按照第5节中的要求进行维持。

4. 在 DIV 0 时为神经前体细胞接种准备培养表面

1. 至少在铺板前1天准备组织培养处理的培养皿。加入足量的聚乙烯亚胺（PEI；25 µg/ml，溶于无菌H₂O）₂O) 或聚-D-赖氨酸（PDL；100 µg/ml，溶于无菌 H₂O）覆盖经组织培养处理的塑料培养皿，并在37°C下孵育过夜。
2. 铺板当天早晨，用双蒸水将培养皿洗涤两次₂O 和 PBS 各一次。最后一次洗涤后，加入足量 N2 培养基以覆盖培养皿（例如， 12孔板每孔1 ml，或6 cm培养皿每皿4 ml。
3. 至少在神经元接种前一天准备18 mm玻璃盖玻片。使用等离子清洗仪清洗盖玻片4分钟。
4. 立即将清洗后的盖玻片转移至大型无菌培养皿底部预先用乙醇清洗过的Parafilm膜上，加入400 µl按步骤4.1配制的PEI或PDL溶液。于37 °C细胞培养孵箱中孵育过夜（O/N）。
5. 清晨，用去离子水洗涤盖玻片3次，加入含5 µg/ml 层粘连蛋白（laminin）的PBS溶液，37 °C孵育1 - 3小时。在解离神经元前，吸除层粘连蛋白溶液，立即将盖玻片转移至含有1 ml NPC培养基的12孔板的一个孔中，注意保持处理面向上。
6. 将培养皿和盖玻片置于37 °C下保存，直至神经前体细胞准备铺板。

5. 神经元的维持

1. 在 DIV 1 时，吸除培养基，并更换为 N2 培养基。
2. 在 DIV 2 和 DIV 4 时，吸除培养基，并更换为 B27 培养基。
3. 在 DIV 8 时，吸除培养基，并更换为含有有丝分裂抑制剂的 B27 培养基，以清除污染的非神经元细胞。
4. 在 DIV 12 时，更换为 B27 培养基。
5. 在准备就绪前，不要将 DIV 12⁺ 的 ESNs 从 5% CO₂ 环境中移出。

6. 用于定量微小兴奋性突触后电流的突触传递测量抑制（MIST）检测法

注意：梭菌神经毒素是已知最剧烈的毒物，其对人类的半数致死剂量（LD₅₀）估计低至 0.1 - 1 ng/kg。使用此类毒素前须获得必要的审批，并采取适当的防护措施。

1. 将BoNT/A小心稀释至100倍，使其达到ESN培养基中的目标终浓度，并预热至37 ºC。向DIV 21+的ESN培养物中加入适量毒素，轻轻摇动培养皿后放回培养箱。
2. 若细胞在染毒后超过4小时才进行分析，则需在不脱离5% CO₂环境的情况下向培养皿中添加毒素并混匀，例如直接在培养箱内或恒定CO₂环境中操作。
3. 在适当时间点，吸除ESN培养基，并用细胞外记录缓冲液（ERB）洗涤两次。加入4 ml ERB，其中添加5.0 µM河豚毒素（tetrodotoxin）和10 µM荷包牡丹碱（bicuculline），分别用于阻断动作电位和拮抗GABA_A受体活性。
4. 将培养皿转移至电生理记录装置。MIST检测无需灌流或温度控制。
5. 使用微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成记录电极，使其电阻为5–10 mΩ，并用细胞内记录缓冲液灌注。记录前将灌注好的电极轻轻浸入硅化试剂中处理。
6. 使用充满空气的注射器，在将记录电极下降至ERB溶液过程中施加正压。当电极轻柔地接触待记录神经元的胞体后，撤去正压并形成吉欧封接（gigaseal）。将钳制电压降至-70 mV，随后小心施加负压以进入全细胞记录模式。
7. 切换至电流钳模式，监测并记录静息膜电位。若未校正液接电位，静息膜电位通常介于-67至-82 mV之间。
8. 在-70 mV电压钳模式下连续记录4–5分钟，以检测微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）。
9. 使用峰检测软件对4分钟的记录数据进行mEPSC分析，参数设置如下：阈值，5；搜索局部最大值的时间窗口，10,000 µsec；峰值前用于基线确定的时间，5,000 µsec；搜索衰减时间的窗口，20,000 µsec；用于确定衰减时间的峰值比例，0.37；基线平均时间，1,000 µsec；面积阈值，20；用于平均峰值的点数，1；峰方向，负向。
10. 收集并保存检测到的事件信息。将4分钟内检测到的事件总数除以240，计算出mEPSC频率（单位：Hz）。
11. 针对每种处理条件，收集8–12个对照组和8–12个BoNT处理组的mEPSC频率数据。将处理组数据与同批次、同龄期的对照组进行比较。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett's post-hoc检验，评估突触活动抑制率的统计学显著性。

结果

图 1. 悬浮培养适应的 ESNs 保持有丝分裂稳定性并表达多能性标志物。 （A）ESC 维持与分化的示意图。视黄酸（RA）或白血病抑制因子（LIF）的存在与否以 + 或 – 标记。体外培养天数（DIV）与原代神经元培养的经典发育阶段（DS）之间的对应关系已提供。（B）R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系在转入悬浮培养后经过五次传代，其增殖速率趋于稳定。（C）流式细胞术数据显示，在悬浮培养中连续传代 25 次期间，R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系的 Oct3/4 表达水平未发生显著变化（每组 n = 6）。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表1. ESC 和 ESN
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	培养基：ESC 培养基
			配方与备注：500 mL
100x MEM NEAA	Life Technologies	11140-050	培养基：4 °C 保存，最长1个月
			配方与备注：6 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	6 mL
ES 认证 FBS	Applied Stem Cell	ASM-5007	90 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	3 mL
55 mM 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023	1.1 mL
107 Units/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	培养基：ESC 分化培养基
			配方与备注：436.6 mL
100x MEM NEAA	Life Technologies	11140-050	培养基：4 °C 保存，最长1个月
			配方与备注：5 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
ESC 认证血清	Applied Stem Cell	ASM-5007	50 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
55 mM 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023	0.9 mL
Dulbecco's PBS	Sigma-Aldrich	D8537	培养基：NPC 消化培养基
			配方与备注：100 mL
0.5 M EDTA (18.3%)	Sigma-Aldrich	3690	培养基：分装后冻存，每份5 mL
			配方与备注：0.266 mL
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
聚乙烯亚胺 (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	培养基：表面包被溶液
			配方与备注：H₂O 中配制成 2.5 µg/mL
聚-D-赖氨酸 (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	培养基：1周内使用
			配方与备注：H₂O 中配制成 100 µg/mL
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	5 µg/mL in H₂O
DMEM/F12 + GlutaMAX	Life Technologies	10565-018	培养基：NPC 培养基
			配方与备注：492.5 mL
100x N2 维生素	Life Technologies	17502-048	培养基：4 °C 保存，最长1个月
			配方与备注：5 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
Neurobasal A	Life Technologies	10888-022	培养基：ESN 培养基
			配方与备注：482.5 mL
50x B27 维生素	Life Technologies	17504-044	培养基：4 °C 保存，最长1个月
			配方与备注：10 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
5-氟-2'-脱氧尿苷 (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	培养基：2000倍有丝分裂抑制剂，分装后 -20 °C 保存
			配方与备注：将 150 mg 5FDU 和 350 mg 尿苷溶于 10 mL Neurobasal A 中。无菌过滤，分装后冻存。ESN 培养基中使用 2000倍稀释液。
尿苷	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express 胰蛋白酶	Life Technologies	12605-010	培养基：其他
			配方与备注：室温保存
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	室温保存
大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)	Sigma-Aldrich	T6414	-20 °C 保存
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	室温保存
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403	将 100 mg 抗坏血酸溶于 5.7 mL DMSO/乙醇 (50:50) 混合液中，配制成 100 mM 储存液。
视黄酸 (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	将 15 mg RA 溶于 9 mL DMSO/乙醇 (50:50) 混合液中，加入 1 mL 100 mM 抗坏血酸储存液。分装后 -80 °C 保存，可稳定保存6个月。
表2. MIST
NaCl	Sigma-Aldrich	71386	培养基：细胞外记录缓冲液
			终浓度 (mM)：58.44
			分子量：140
KCl	Sigma-Aldrich	60135	培养基：(ERB; pH = 7.3, 315 mO)
			终浓度 (mM)：74.56
			分子量：3.5
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S3139	培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定
			终浓度 (mM)：119.98
			分子量：1.25
CaCl₂	Sigma-Aldrich	21115	终浓度 (mM)：110.98
			分子量：2
MgCl₂	Sigma-Aldrich	63069	终浓度 (mM)：95.21
			分子量：1
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8644	终浓度 (mM)：180.16
			分子量：10
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	终浓度 (mM)：238.3
			分子量：10
K-葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	P1847	培养基：细胞内记录缓冲液
			终浓度 (mM)：234.5
			分子量：140
NaCl	Sigma-Aldrich	71386	培养基：(IRB; pH = 7.3, 320 mO)
			终浓度 (mM)：58.44
			分子量：5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定
			终浓度 (mM)：507.18
			分子量：2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	G5884	终浓度 (mM)：523.18
			分子量：0.5
CaCl₂	Sigma-Aldrich	21115	培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定
			终浓度 (mM)：110.98
			分子量：0.1
MgCl₂	Sigma-Aldrich	63069	培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定
			终浓度 (mM)：95.21
			分子量：1
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定 终浓度 (mM)：380.35 分子量：1
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	培养基：4 °C 保存，至少6个月稳定
			终浓度 (mM)：238.3
			分子量：10
荷包牡丹碱	Tocris	131	培养基：其他
			终浓度 (mM)：0.01
			分子量：417.85
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	终浓度 (mM)：0.01
			分子量：276.12
河豚毒素	Sigma-Aldrich	A8001	终浓度 (mM)：0.005
			分子量：645.74
BoNT/A-/G	Metabiologics	N/A	培养基：
			终浓度 (mM)：待定
			分子量：150,000
破伤风毒素	Sigma-Aldrich	T3194	终浓度 (mM)：待定
			分子量：150,000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	终浓度 (mM)：N/A
			分子量：N/A
表3. 仪器与软件
MiniAnalysis (版本 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/A	事件检测软件
Igor Pro (版本 6.22A)	WaveMetrics	N/A	记录数据可视化软件
Patchmaster	Heka	N/A	数据采集软件
Olympus IX51 倒置显微镜	Olympus	N/A
显微操作器	Sutter Instrument	MPC-365
膜片钳放大器	Heka	ECB10USB
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000
硼硅酸盐毛细管	Sutter Instrument	B150-86-10	Corning 7740
18 mm 玻璃盖玻片	Fisher	12-545-84
等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-32G
细胞筛 (40 µm)	Fisher	08-771-1
Stovall Belly Dancer 摇床	Fisher	15-453-211
低吸附培养皿	Fisher	05-539-101	Corning 3262
细菌培养皿	VWR	25384-302	100 x 15 mm