使用伯氨喹和光动力疗法测量巨噬细胞吞噬效率

摘要

来源：
Uju L. Madu¹, Maphori Maliehe¹, Nozethu Mjokane¹, Olihile M. Sebolai<sup>1

1</sup>自由州大学微生物学与生物化学系。

该视频展示了普鲁卡因联合光动力治疗对小鼠巨噬细胞吞噬效率的影响。经处理的感染巨噬细胞产生活性氧，导致真菌选择性死亡，平板上菌落数量减少即为明证。

方案

1. 准备 隐球菌 细胞

1. 用接种环将待测微生物划线接种于无菌的酵母麦芽提取物（YM）琼脂平板上。
2. 将琼脂平板在30°C条件下培养48小时。
3. 用接种环挑取5个单菌落，悬浮于5 mL无菌蒸馏水中。
4. 使用麦氏比浊标准液对细胞进行标准化，使细胞浓度达到每毫升RPMI-1640培养基中含有0.5 × 10⁵ 至 2.5 × 10⁵ 个菌落形成单位（CFU）。
5. 取100 µL细胞悬液加入已接种巨噬细胞的微量滴定板孔中（见下文部分）。

2. 巨噬细胞的制备

1. 在含有10 mL RPMI-1640培养基的组织培养瓶中培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，培养基中添加20 mg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、20 U/mL青霉素和10%胎牛血清。
2. 将培养瓶置于37°C、5% CO₂的培养箱中，直至细胞融合度达到80%。
3. 使用细胞刮轻轻刮下细胞。
4. 将悬浮细胞转移至15 mL离心管中。
5. 使用台盼蓝染色法测定细胞活力。
   注意：细胞活力高于85%为宜。
6. 使用血细胞计数板，用10 mL新鲜无菌RPMI-1640培养基将巨噬细胞浓度调整至1 × 10⁶ 个细胞/mL。
7. 将100 µL细胞悬液加入无菌96孔平底微孔板的各孔中。
8. 将微孔板在37°C、5% CO₂培养箱中孵育过夜。
   注意：使用前应吸除过夜培养的旧培养基，并更换为100 µL新鲜无菌的Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培养基。

3. 化合物制备

1. 将待测光敏剂和伯氨喹（PQ）溶解于蒸馏水中，配制储备液。
2. 用 RPMI-1640 培养基进一步稀释该化合物。
   注意：RPMI-1640 培养基中蒸馏水的最终体积不得超过 1%。
3. 向已接种巨噬细胞和隐球菌细胞的适当孔中加入 100 µL 光敏剂溶液，其浓度应为所需浓度的四倍。

4. 光动力治疗（PDT）的实施

1. 设置以下实验条件：
   1. 与 0 µM PQ 共培养的细胞，并在暗光（DL）下暴露 2 分钟（即未处理（non-Rx）细胞）
   2. 与 6 µM PQ 共培养的细胞，并在暗光（DL）下暴露 2 分钟（即药物效应）
   3. 与 15 µM PQ 共培养的细胞，并在暗光（DL）下暴露 2 分钟（即药物效应）
   4. 与 30 µM PQ 共培养的细胞，并在暗光（DL）下暴露 2 分钟（即药物效应）
   5. 与 0 µM PQ 共培养的细胞，并在紫外光（UV）下暴露 2 分钟（即紫外效应）
   6. 与 6 µM PQ 共培养的细胞，并在紫外光（UVL）下暴露 2 分钟（即光动力疗法效应）
   7. 与 15 µM PQ 共培养的细胞，并在紫外光（UVL）下暴露 2 分钟（即光动力疗法效应）
   8. 与 30 µM PQ 共培养的细胞，并在紫外光（UVL）下暴露 2 分钟（即光动力疗法效应）
      注意： 共培养的细胞必须在黑暗中与 PQ 反应 30 分钟（如适用），然后再进行紫外光（UVL）照射（如适用）。
      注意： 在本研究中，我们确定 PQ 在 260 nm 处具有紫外/可见光吸收，该波长位于杀菌灯的紫外范围内。基于此，我们使用安装在 II 级生物安全柜内的杀菌性紫外 C（UVC）灯作为光源以实施光动力疗法（PDT）。该灯的标称功率为 30 瓦。在本研究中，细胞放置在距离光源约 20 cm 的位置。在此距离下，灯的辐射输出估计为 625 µW/cm²。

5. 计数菌落以确定存活率 隐球菌 细胞

1. 在按照上述方法启动共培养细胞的光动力治疗后，将培养板于37℃孵育°C，5% CO₂₂ 18小时。
2. 孵育18小时后，吸除上清液。
3. 用200洗涤各孔 µ加入 L 磷酸盐缓冲液（PBS）以洗去未内化的细胞，重复此步骤三次。
4. 加入300 µ加入 0.1% Triton X-100 溶液至各孔中，并于室温孵育 10 分钟。
5. 吸出孔内液体，并将其加入无菌的1.5 mL塑料离心管中。
6. 用蒸馏水将细胞稀释10倍。
   注意： 调整稀释度，以便在琼脂平板上能够回收30到300个菌落。
7. 移液50 µ将稀释液的 L 接种到酵母麦芽（YM）琼脂平板上。
8. 采用涂布平板法在琼脂平板表面形成致密的细胞菌苔。
9. 将平板在30℃下孵育˚°48 小时，温度为 C
10. 计数琼脂平板上形成的菌落形成单位（CFUs）。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 琼脂 默 克 用于制备 YM 板 酵母提取物 默 克 用于制备 YM 板 麦芽提取物 默 克 用于制备 YM 板 蛋白胨 默 克 用于制备 YM 板 葡萄糖 默 克 用于制备 YM 板 台盼蓝染色 西格玛-奥德里奇 枚举活细胞和死细胞 麦克法兰标准 Fisher Scientific 公司 标准化细胞 伯氨喹 默 克 用作光敏剂 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 西格玛-奥德里奇 洗涤和稀释细胞 RPMI- 1640 培养基 生物色 巨噬细胞培养基 胎牛血清 （FBS） 生物色 用于补充 RPMI-1640 培养基 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺 西格玛-奥德里奇 添加到 RPMI-1640 培养基中 0.1% 海卫一 X-100 西格玛-奥德里奇 用于裂解巨噬细胞 96 孔平底微量滴定板 格雷纳生物一号 用作进行反应的容器 组织培养瓶 拉塞克 用于培养巨噬细胞 50 mL 离心管 拉塞克 用于容纳巨噬细胞 细胞刮板机 拉塞克 用于从组织培养瓶中分离巨噬细胞 接种环 拉塞克 用于将培养物划线到琼脂平板上 血球计数器 马林菲尔德 测定巨噬细胞的细胞浓度 1.5 mL 塑料管 默 克 用作进行反应的容器 UVL ESCO 用于活化光敏剂 CO2 培养箱 赛默飞世尔 用于孵育巨噬细胞 II 类生物安全柜 ESCO 安全地与病原体一起工作，而不会对用户造成伤害。