阿司匹林和布洛芬对巨噬细胞吞噬能力的影响

摘要

来源：
Adepemi O. Ogundeji¹，Nozethu Mjokane¹，Maphori Maliehe¹，Olihile M. Sebolai<sup>1

1</sup>自由州大学微生物学与生物化学系。

本视频展示了一种利用pH敏感型荧光染料标记的真菌细胞，评估阿司匹林和布洛芬在其最低抑菌浓度下对巨噬细胞吞噬作用影响的方法。这些药物通过抑制环氧化酶-2，减少前列腺素的生成，从而增强巨噬细胞的吞噬功能，该效应可通过pH敏感型荧光染料的荧光检测结果观察到。

方案

1. 安全注意事项

1. 工作人员应使用个人防护装备（PPE）。
2. 在II级生物安全柜中操作病原体和巨噬细胞。

2. 巨噬细胞的制备

1. 在含有 10 mL Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) 培养基的组织培养瓶中培养小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7，培养基中添加 20 mg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、20 U/mL 青霉素和 10% 胎牛血清 (FBS)。
2. 将培养瓶置于 37˚C、5% 二氧化碳 (CO₂) 的培养箱中，直至细胞融合度达到 80%。
3. 使用细胞刮轻轻刮下细胞。
4. 将悬浮细胞转移至 15 mL 离心管中。
5. 使用台盼蓝染色法测定细胞活力。 
   注意：细胞活力应高于 85% 为宜。
   使用血细胞计数板，用 10 mL 新鲜无菌 RPMI-1640 培养基将巨噬细胞浓度调整至 1 × 10⁵     个细胞/mL。 将 100 µL 细胞悬液加入无菌 96 孔平底微孔板的各孔中。在 37˚C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
   注意：使用前应吸除过夜培养的旧培养基，并更换为 100 µL 新鲜无菌 RPMI-1640 培养基。

3. 隐球菌细胞的制备

1. 用接种环将待测微生物划线接种于无菌的酵母麦芽提取物（YM）琼脂平板上。
2. 将琼脂平板在 30˚C 条件下培养 48 小时。
3. 用接种环取一环菌体，接种至 100 mL 添加了 4% 葡萄糖的酵母氮源基础（YNB）液体培养基中。
4. 在 30˚C、160 rpm 振荡条件下过夜培养菌体（预培养）。
5. 次日，取 0.1 mL 预培养液接种至新鲜 YNB 液体培养基（主培养），在相同培养条件下培养至对数生长中期。
6. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将菌体清洗两次。
7. 使用血细胞计数板，将菌悬液调整至 PBS 中细胞浓度为 1 × 10⁵。

4. 使用吞噬作用染色剂对隐球菌细胞进行染色

1. 取 999 µL 细胞悬液加入 1.5 mL 塑料离心管中。
2. 向同一管中加入 1 µL pHrodo green zymosan A 染料。
3. 将细胞在室温下避光孵育 1 小时，并缓慢振荡以使染料充分反应。
4. 孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次。
5. 将 100 µL 细胞悬液加入已接种巨噬细胞的孔中。

5. 药物的制备

1. 使用1 mg阿司匹林溶于1000 mL无水乙醇中，配制储备液，终浓度为1000 µg/mL。
2. 将该化合物进一步用RPMI-1640培养基稀释至所需药物浓度。
   注意：RPMI-1640培养基中乙醇的最终体积分数不得超过1%。使用1 mg布洛芬溶于1000 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制布洛芬储备液。将该化合物进一步用RPMI-1640培养基稀释至所需药物浓度。
   注意：RPMI-1640培养基中DMSO的最终体积分数不得超过1%。将上述配制的药物溶液配制成终浓度4倍的100 µL溶液，并加入已接种巨噬细胞和隐球菌细胞的相应孔板中。

6. 化学增敏剂对巨噬细胞吞噬作用的影响

1. 在37˚C、5% CO₂ 培养箱中，将共培养的细胞与化学增敏剂、阿司匹林或布洛芬共同孵育2小时或6小时。
2. 孵育结束后，检测诱导产生的荧光（激发波长：492 nm，发射波长：538 nm）。
   注意：pHrodo染料仅在酸性环境（如吞噬体内部）中产生荧光。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 琼脂 默 克 用于制备 YM 板 酵母提取物 默 克 用于制备 YM 板 麦芽提取物 默 克 用于制备 YM 板 蛋白胨 默 克 用于制备 YM 板 酵母氮碱 （YNB） 迪夫科实验室 用于隐球菌细胞的培养 葡萄糖 默 克 用于制备 YM 板 台盼蓝染色 西格玛-奥德里奇 枚举活细胞和死细胞 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 西格玛-奥德里奇 洗涤和稀释细胞 RPMI- 1640 培养基 生物色 巨噬细胞培养基 胎牛血清 （FBS） 生物色 用于补充 RPMI-1640 培养基 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺 西格玛-奥德里奇 添加到 RPMI-1640 培养基中 pHrodo 绿色酵母聚糖 A 染色剂 Life Technologies 公司 用于因 pH 值变化而对内化细胞进行染色 乙酰水杨酸（阿司匹林） 西格玛-奥德里奇 待测药物 无水乙醇 默克 用于溶解阿司匹林 布洛芬 西格玛-奥德里奇 待测药物 二甲基亚砜 （DMSO） 默克 用于溶解布洛芬 96 孔平底微量滴定板 格雷纳生物一号 用作进行反应的容器 组织培养瓶 拉塞克 用于培养巨噬细胞 15 mL 离心管 拉塞克 用于容纳巨噬细胞 细胞刮板机 拉塞克 用于从组织培养瓶中分离巨噬细胞 接种环 拉塞克 用于将培养物划线到琼脂平板上 血球计数器 马林菲尔德 测定巨噬细胞的细胞浓度 1.5 mL 塑料管 默 克 用作进行反应的容器 EZ Read 800 Research 分光光度计 生物色 读取光密度 Fluoroskan Ascent 佛罗里达州 Thermo Scientific 公司 测量荧光 CO₂ 培养箱 赛默飞世尔 用于孵育巨噬细胞 II 类生物安全柜 ESCO 安全地与病原体一起工作，而不会对用户造成伤害。