一种用于检测人巨细胞病毒中和作用的免疫荧光方法

摘要

来源：
Matthew J Murray¹, Gary R McLean^2,3, Matthew B Reeves<sup>1

1</sup>伦敦大学学院移植与免疫研究所。
²伦敦都会大学细胞与分子免疫学研究中心。
³帝国理工学院国家心肺研究所。

本视频展示了一种免疫荧光检测方法，用于测定人巨细胞病毒（HCMV）的中和作用。将病毒特异性抗体与病毒混合后，共同孵育人成纤维细胞。抗体可中和病毒，使其失去感染宿主细胞的能力，而未被中和的病毒则能够感染细胞。孵育结束后，通过免疫荧光法对被病毒感染的细胞进行定量，从而确定中和程度。

方案

1. 感染用靶细胞的制备

1. 在进行实验的前一天，将靶细胞接种于96孔板（“靶”板）中。
2. 每孔接种足够数量的细胞，以确保形成几乎完全融合（约90%）的单层细胞。
   注意：接种密度取决于靶细胞类型的相对大小。若使用人包皮成纤维细胞（HFFs），每孔接种20,000个细胞。
3. 通常每份样品应接种21个孔（纵向7孔 × 横向3孔），每块板可分析4份样品。
4. 每块板额外接种12个孔（即第8行），作为对照。

2. 病毒：抗体混合物的制备

1. 向新的96孔板第1行的3个孔（“稀释”板）中，每孔加入90 µL培养基与抗体的混合液（充分混匀），使抗体初始测试浓度为所需浓度的两倍。
   注意： 抗体的起始浓度通常为 20 µg/mL，但应通过实验确定。
2. 向从上述3个孔向下6行、横向3列的共18个孔中，每个孔加入60 µL培养基 步骤 2.1.
3. 向另外12个孔（即第8行）中各加入60 µL培养基。 
4. 从第1行将30 µL抗体稀释液转移至第2行对应的孔中。
5. 用多通道移液器轻柔地上下吹打第2行各孔内容物20次，充分混匀。 
6. 从第2行将30 µL抗体稀释液转移至第3行。
7. 重复混合与转移操作，直至第7行的所有内容均被混匀。
8. 第7行混匀后，弃去第7行各孔中的30 µL液体。
9. 用完全培养基稀释HCMV，使50 µL中含有足够的感染性病毒颗粒，直接加入细胞后可实现MOI=1的感染。
   注意： HCMV 属于生物安全等级 2（BSL-2）病原体。应确保采取适当的安全防护措施，并对所有接触过 HCMV 的培养基使用带滤芯的吸头。
   注意： 这需要每个孔的感染性病毒颗粒数量与细胞数量相等，具体数值取决于细胞类型和病毒嗜性。若按上述使用HFF细胞，则所需病毒浓度为4x10⁵ pfu/mL
   注意： 确保制备足量的稀释病毒（例如，多出10%）。
10. 向所有含抗体稀释液的孔以及6个仅含60 µL培养基的孔中加入60 µL稀释后的病毒原液。
11. 向其余6个仅含培养基的孔中各加入60 µL培养基，作为未感染对照。
12. 将所得的病毒：抗体混合物在37℃孵育^o1小时，C

3. 靶细胞感染

1. 移除靶细胞中的所有培养基。
2. 使用多通道移液器，将“稀释”板中相应位置的 100 µL 病毒：抗体混合液转移至“靶”板中对应位置的细胞上。
3. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

4. 细胞固定

1. 移除细胞中的所有培养基。
   注意：此步骤中无需在不同孔之间更换吸头。
2. 用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤所有孔，并吸去液体。
3. 向所有孔中加入 180 µL -20 ^oC 的 100% 乙醇。
4. 将培养板置于 -20 ^oC 下孵育至少 30 分钟。
   注意：若乙醇开始蒸发，可补充乙醇，孵育时间可延长至至少一个月。
   注意：从此步骤开始，培养板可在 BSL-1 条件下安全操作，可使用非滤芯吸头。 

5. 通过免疫荧光法（IF）检测病毒感染细胞

1. 从孔板中移除乙醇。
2. 用 200 µL PBS 洗涤所有孔，并吸去液体。
3. 向所有孔中加入 200 µL PBS，孵育 5 分钟。
   1. 同时，在 PBS 中配制一抗稀释液。
   2. 每孔需要 100 µL 1:2000 稀释的小鼠单克隆抗 IE 抗体（注意：该稀释比例针对材料列表中指定的特定抗体）。
      ​注意： 若使用其他抗体，用于免疫荧光的抗体稀释比例可能需要优化。
   3. 涡旋混合，确保充分混匀。
4. 吸去所有孔中的 PBS，每孔加入 100 µL 一抗稀释液。
5. 室温孵育 1 小时。
6. 从所有孔中移除一抗溶液。
7. 向所有孔中加入 200 µL PBS，孵育 5 分钟。
   1. 同时，在 PBS 中配制二抗和 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）稀释液。
   2. 每孔需要 100 µL 1:2000 稀释的荧光素偶联抗小鼠 IgG 抗体和 1 µg/mL DAPI。
   3. 注意： 若使用其他二抗，用于免疫荧光的二抗稀释比例可能需要优化。
   4. 涡旋混合，确保充分混匀。
8. 吸去所有孔中的 PBS，每孔加入 100 µL 二抗/DAPI 稀释液。
9. 将孔板置于室温孵育 1 小时，避光。
10. 从所有孔中移除二抗/DAPI 溶液。
11. 用 200 µL PBS 洗涤所有孔，并吸去液体。
12. 向所有孔中加入 200 µL PBS，孵育 5 分钟。
13. 吸去 PBS，每孔加入 100 µL PBS，避光保存于 4 ^oC，直至准备成像。
    注意： 孔板可保存长达一个月，信号/图像质量无明显损失。

6. 感染细胞的成像与计数

1. 为简便且准确地量化感染情况，需在每个孔中至少对25%的区域进行成像，同时采集蓝色（DAPI，细胞核）和二抗（HCMV即刻早期蛋白（IE））通道的图像。
   注意： IE免疫荧光产生的信号应与细胞核染色信号相似，应检查图像以确认这一点。
2. 此步骤可手动完成，但建议使用自动显微镜。
   注意： 放大倍数取决于所用仪器，但由于成像目标为较大结构（细胞核），通常使用4X/10X物镜已足够。
3. 获取图像后，通过所选的软件分析程序进行处理。
   1. 首先通过蓝色通道识别细胞核，以计算存在的细胞数量。
   2. 由于IE为定位于细胞核的蛋白，仅需在红色通道中检查上述已识别的细胞核区域，以计算感染细胞的数量。
4. 在计算出感染细胞数和总细胞数后，按每孔计算感染百分比。
5. 可通过从所有其他孔的感染百分比中减去未感染孔中观察到的平均感染百分比，对这些数值进行背景信号校正。
   注意： 该值应远低于1%。若超过1%，则分析流程需进一步优化。
6. 现在可对这些经背景校正后的数值进行绘图、查询和进一步分析。

材料