使用染料标记的磁性微球进行多重定量细菌检测

摘要

来源：
Rhea Kang¹, Gabby Mora¹, Sherry Dunbar<sup>1

1</sup>Luminex, A DiaSorin Company, Austin.

本视频展示了利用染色成不同组别的羧基化磁性聚苯乙烯微球进行多重定量细菌检测的方法。该过程包括形成微球-细菌复合物、磁性分离以及基于流式分析，从而能够在同一反应孔中精确且同时地定量多种细菌。

方案

1. 将捕获抗体共价偶联至 MagPlex 微球

每种捕获抗体均通过以下所述的两步法与特定的羧基化磁性微球集合进行偶联。

注意：也可提供包含微球偶联所需全部试剂、缓冲液和材料的偶联试剂盒（参见材料表）。 

1. 根据微球产品信息表中所述的说明，重悬储存的未偶联微球悬浮液。
   注意：重悬说明将取决于您储存微球管的大小和体积。
2. 将 2.5 × 10⁶ 个储存微球转移至推荐的微量离心管中（参见 材料表）。
3. 将管子放入磁力分离器中，静置 60 秒以完成分离。
4. 保持管子仍在磁力分离器中，小心移除上清液。 
   注意：操作时注意不要扰动微球。
5. 从磁力分离器中取出管子，加入 100 µL 去离子水（dH₂O），通过涡旋振荡和超声处理 20 秒，使微球重悬。
6. 重复步骤 3 和 4。
7. 从磁力分离器中取出管子，加入 80 µL 0.1 M 单碱磷酸钠缓冲液（pH 6.2），通过涡旋振荡和超声处理 20 秒，使洗涤后的微球重悬。
8. 向微球中加入 10 µL 浓度为 50 mg/mL 的 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（sulfo-NHS）（用 0.1 M 单碱磷酸钠缓冲液，pH 6.2 稀释），轻轻涡旋混匀。
9. 向微球中加入 10 μL 浓度为 50 mg/mL 的 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）（用 0.1 M 单碱磷酸钠缓冲液，pH 6.2 稀释），轻轻涡旋混匀。
10. 室温孵育 20 分钟，每隔 10 分钟轻轻涡旋混匀一次。
11. 将管子放入磁力分离器中，静置 60 秒以完成分离。
12. 保持管子仍在磁力分离器中，小心移除上清液。 
    注意：操作时注意不要扰动微球。
13. 从磁力分离器中取出管子，加入 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），通过涡旋振荡和超声处理约 20 秒，使微球重悬。
14. 将管子放入磁力分离器中，静置 60 秒以完成分离。
15. 保持管子仍在磁力分离器中，小心移除上清液。 
    注意：操作时注意不要扰动微球。
16. 重复步骤 13 至 15，共进行两次洗涤。
17. 从磁力分离器中取出管子，加入 100 µL PBS（pH 7.4），通过涡旋振荡和超声处理约 20 秒，使活化并洗涤后的微球重悬。
18. 向重悬的微球中加入 12.5 μg 捕获抗体（即每 100 万个微球加入 5 μg）。
    注意：捕获抗体优先选用单克隆抗体，但也可使用多克隆抗体。
    注意：每 100 万个微球加入 5 μg 蛋白通常效果良好，但我们建议通过滴定确定最佳用量以获得最优检测性能。
19. 用 PBS（pH 7.4）将总体积调至 500 μL。
20. 通过涡旋振荡混合偶联反应体系。
21. 室温避光条件下，旋转混匀孵育 2 小时。
22. 将管子放入磁力分离器中，静置 60 秒以完成分离。
23. 保持管子仍在磁力分离器中，小心移除上清液。
    注意：操作时注意不要扰动微球。
24. 从磁力分离器中取出管子，加入 1 mL 含 0.02% Tween-20、0.1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.05% 叠氮化钠的 PBS 缓冲液（PBS-TBN），通过涡旋振荡和超声处理 20 秒，使偶联后的微球重悬。
25. 将管子放入磁力分离器中，静置 60 秒以完成分离。
26. 保持管子仍在磁力分离器中，小心移除上清液。 
    注意：操作时注意不要扰动微球。
27. 重复步骤 24 至 26，共进行两次洗涤。
28. 从磁力分离器中取出管子，加入 500 µL PBS-TBN 缓冲液，使偶联后的微球重悬。
    注意：使用细胞计数器或血球计数板确定回收的微球数量。
29. 将偶联后的微球置于 2–8°C 避光冷藏保存。
    注意：另有用于确认偶联效率的实验方案可供参考。

2. 检测抗体的生物素标记

1. 使用EZ-Link磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素酰胺)己酸酯，按照制造商说明书对检测抗体进行生物素标记，生物素试剂的摩尔过量20倍，以实现每个抗体分子上标记4–6个生物素基团。
   注意：通常使用多克隆抗体作为检测抗体，但如果单克隆抗体针对的表位与捕获抗体不同，则也可使用单克隆抗体。
   注意：也可选用市售的生物素化抗体作为检测抗体。

3. 通过多重捕获夹心免疫测定法检测生物体

上述步骤1和2中制备的偶联微球组与标记检测抗体，用于多重捕获夹心免疫测定，以检测并定量样本中存在的细菌。图1展示了该检测流程的概览。

1. 从 2-8ºC 的储存环境中取出抗体偶联的 MagPlex 磁珠储备管。
2. 涡旋并超声处理 20 秒。
3. 配制工作用多重磁珠混合液，使每种磁珠在 PBS-TBN 中的终浓度为每 50 µL 反应孔含 2500 个微球（即 50,000 个磁珠/种/mL）。
   注意：使用电子表格计算工作用磁珠混合液的配制参数。
   注意：可加入内参磁珠（RP1 监测微球）以监控实验和仪器性能。
4. 用移液器向 96 孔板的相应孔中加入 50 µL 工作用磁珠混合液。
5. 向相应孔中加入 50 µL 标准品或样本。
6. 向每个背景孔中加入 50 µL PBS-TBN。
7. 用铝箔封膜封板，避免磁珠暴露于光线下，并在室温下以 800 rpm 振荡孵育 1 小时。
8. 将板置于磁板分离器上静置 1 分钟。
9. 保持板在磁板分离器上，小心移除铝箔，将板倒置以排空孔内液体，然后在厚层实验室纸巾上轻拍 3-4 次使其干燥。
   注意：也可使用多通道移液器手动抽吸，或使用自动洗板机。
10. 使用多通道移液器向每孔加入 200 µL PBS-TBN，并在 800 rpm 条件下振荡 1 分钟。
11. 将板置于磁板分离器上静置 1 分钟。
12. 保持板在磁板分离器上，将板倒置以排空孔内液体，然后在厚层实验室纸巾上轻拍 3-4 次使其干燥。
    注意：也可使用多通道移液器手动抽吸，或使用自动洗板机。
13. 重复步骤 10-12，共洗涤两次。
    注意：进入下一步前应尽可能去除缓冲液，以避免反应体系被稀释。
14. 使用多通道移液器向每孔加入 50 µL 检测缓冲液，并在 800 rpm 条件下振荡 1 分钟。
15. 将生物素化检测抗体用 PBS-TBN 稀释至 4 µg/mL。
16. 向每孔加入 50 µL 稀释后的检测抗体。
17. 用铝箔封膜封板，避免磁珠暴露于光线下，并在室温下以 800 rpm 振荡孵育 1 小时。
18. 将板置于磁板分离器上静置 1 分钟。
19. 保持板在磁板分离器上，将板倒置以排空孔内液体，然后在厚层实验室纸巾上轻拍 3-4 次使其干燥。
    注意：也可使用多通道移液器手动抽吸，或使用自动洗板机。
20. 按照步骤 10-12 所述程序，每孔洗涤两次。
    注意：进入下一步前应尽可能去除缓冲液，以避免反应体系被稀释。
21. 使用多通道移液器向每孔加入 50 µL 检测缓冲液，并在 800 rpm 条件下振荡 1 分钟。链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）。
22. 将 SAPE 报告试剂用检测缓冲液稀释至 4 µg/mL。
23. 向每孔加入 50 µL 稀释后的 SAPE。
24. 用铝箔封膜封板，避免磁珠和 SAPE 暴露于光线下，并在室温下以 800 rpm 振荡孵育 30 分钟。
25. 将板置于磁板分离器上静置 1 分钟。
26. 保持板在磁板分离器上，将板倒置以排空孔内液体，然后在厚层实验室纸巾上轻拍 3-4 次使其干燥。
    ​注意：也可使用多通道移液器手动抽吸，或使用自动洗板机。
27. 按照步骤 10-12 所述程序，每孔洗涤两次。
28. 向每孔加入 100 µL PBS-TBN，并在 800 rpm 条件下振荡 1 分钟。
29. 使用 Luminex 分析仪（根据所用分析仪的用户手册操作）分析每孔 50 µL 反应液，每种磁珠至少采集 50 个磁珠用于分析。以下简要介绍 xMAP INTELLIFLEX® 的操作步骤：
    1. 点击屏幕左上角的下拉菜单，进入“板配置”（Plate Configuration）。
    2. 选择“运行板”（Run Plate）。
    3. 点击“弹出”（Eject）图标以弹出板架。
    4. 将板放入板架，点击“收回”（Retract）图标以收回板架。
    5. 点击“运行”（Run）图标开始运行板。

结果

图 1:多重捕获夹心免疫测定工作流程。将抗体偶联微球的多重混合物分配到每个孔中，并加入样品。孵育 1 小时后，洗涤反应物，并加入生物素化检测抗体。孵育 1 小时后，再次洗涤反应物，并加入 SAPE 报告基因。将反应物孵育 30 分钟，洗涤，然后在 xMAP 流式分析仪上读取结果。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 MagPlex^® 微球 Luminex® 系列 MC100xx-YY 系列 请访问网站了解各个目录号 （https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order） 1.5 mL 微量离心管 Eppendorf 埃本多夫^™ 22431081 Protein LoBind 蛋白 LoBind® 0.1 M 二元磷酸钠 （NaH₂PO_4），pH 6.2 MilliporeSigma 第 3139 系列 活化缓冲液 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 （EDC） Thermo Scientific^™ 公司 皮尔斯^™ 77149 N-羟基磺基琥珀酰亚胺 （Sulfo-NHS） Thermo Scientific ™ 公司 皮尔斯^™ 24510 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），pH 7.4 MilliporeSigma 第 3813 页 偶联缓冲器 xMAP® 抗体偶联试剂盒 Luminex® 系列 40-50016 提供用于微球耦合的可选套件。 抗大肠埃希菌 O157:H7 抗体 SeraCare 公司 电话:5310-0326 多克隆抗体，用于捕获和检测 抗沙门氏菌 CSA-Plus 抗体 SeraCare 公司 5310-0321 多克隆抗体，用于捕获和检测 抗弯曲杆菌属抗体 SeraCare 公司 5310-0324 多克隆抗体，用于捕获和检测 抗李斯特菌抗体 SeraCare 公司 5310-0319 多克隆，属特异性，用于捕获和检测 PBS，pH 7.4，含 0.02% 吐温-20、0.1% BSA、0.05% 叠氮化钠 （PBS-TBN） MilliporeSigma P3563
A7888
S8032 系列 最多可使用1% BSA 抗大肠杆菌 O157:H7 抗体 SeraCare 公司 电话:5310-0326 多克隆 （EZ-Link 磺基-NHS-LC-生物素）（皮尔斯）。 Thermo Scientific™ 公司 编号 A39257 大肠杆菌 O157:H7 SeraCare 公司 5370-0013 热灭活 沙门氏菌
血清型 鼠伤寒 SeraCare 公司 5370-0002 热灭活 空肠弯曲杆菌 SeraCare 公司 5370-0011 热灭活 单核细胞增生李斯特菌 SeraCare 公司 邮编:5370-0010 热灭活 链霉亲和素、R-藻红蛋白偶联物 （SAPE） Thermo Scientific™ 公司 S866 系列