中性粒细胞蛋白质的分离与消化

摘要

来源：
Tia Rizakos¹, Jennifer Geddes-McAlister<sup>1

1</sup>圭尔夫大学分子与细胞生物学系。

本视频展示了从中性粒细胞中分离蛋白质的过程，随后对蛋白质进行处理并消化成较小的肽段。这些肽段可用于后续分析。

方案

1. 中性粒细胞收集与裂解 

1. 将样品在400 × g 条件下离心5分钟，用15 mL离心管收集中性粒细胞分化后的HL60细胞。 
   注意： 分化后中性粒细胞的密度应达到3.5 × 10⁵ 个细胞/mL。  每次实验需收集约五百万个细胞用于全蛋白质组提取。 
2. 弃去上清液，向离心管中加入15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
3. 在400 × g 条件下离心5分钟。
4. 重复步骤1.2至1.3。 
   注意： 根据实验时间安排，可在完成步骤1.4后使用液氮速冻细胞样品，并于-80°C保存。 
5. 向每个样品中加入300 μL含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）片剂的冰冷100 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液，pH 8.5。 
6. 短暂涡旋振荡样品。 
7. 加入1/10体积的20%十二烷基硫酸钠（SDS），使终浓度为2% SDS。
8. 为裂解细胞样品，将样品置于冰浴中进行探头超声处理，功率设为10%，每次超声30秒，间隔30秒，共循环5次。 
9. 对样品进行短时离心（最大转速离心5–10秒）。
   注意： 不要让细胞碎片形成沉淀，短时离心仅用于收集附着在管壁上的液滴。
10. 将样品从15 mL离心管转移至2 mL离心管中。 
11. 加入1/10体积的1 M储存液二硫苏糖醇（DTT），使终浓度为10 mM DTT。 
12. 短暂涡旋振荡样品。
13. 在95°C、800 rpm振荡条件下孵育10分钟。
14. 孵育10分钟后，将样品冷却至室温。
    注意： 可将样品置于冰上以加快冷却过程。 
15. 加入1/10体积的0.55 mM碘乙酰胺（IAA），使终浓度为 55 mM IAA。
    注意： 步骤1.15需在避光条件下操作，避免IAA暴露于光照。 
16. 短暂涡旋振荡样品。
17. 在室温下避光孵育20分钟。 
18. 加入终浓度为80%的冰冷100%丙酮，于-20°C过夜保存。 
    注意： 如有需要，样品可在-20°C保存长达两周。

2. 中性粒细胞蛋白质的消化 

1. 将样品在 4°C 下以 13,500 rpm 离心 10 分钟，以沉淀细胞沉淀物。 
2. 弃去上清液，并用 500 μl 预冷的 80% 丙酮洗涤细胞沉淀物。
3. 将样品在 4°C 下以 13,500 rpm 离心 10 分钟，然后移除上清液。 
4. 重复步骤 2.1 至 2.3。 
5. 将沉淀物在空气中干燥。 
6. 干燥后，向细胞沉淀物中加入 100 μl 8 M 尿素/40 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)，并在 4°C 水浴中超声处理，每次开启 30 秒，关闭 30 秒，共循环 15 次，以重新溶解蛋白质沉淀物。 
7. 使用牛血清白蛋白 (BSA) 色氨酸测定法（或等效方法）按照制造商说明书定量蛋白质浓度。 
8. 加入 300 μl 碳酸氢铵 (ABC)，将样品稀释至终浓度为 2 M 尿素。 
9. 为消化 50 μg 蛋白质，将胰蛋白酶/赖氨酰内切酶 (Trypsin/LysC) 按酶与蛋白质比例 1:50 加入冰上的样品中——通过轻轻敲击混匀样品。
10. 将样品在室温下孵育过夜以完成消化。 

结果

图 1.分化为中性粒细胞的 HL60 细胞的工作流程，用于基于质谱的蛋白质组学分析。培养、收集和处理未分化和分化 （通过 DMSO 化学刺激） HL60 细胞系用于总蛋白质组提取。用胰蛋白酶/LysC 消化蛋白质，使用 C18 STAGE-tips 纯化肽，然后用 LC-MS/MS 检测。使用 MaxQuant 和 Perseus 进行数据分析。使用 Biorender.com 生成的图

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 15 ml Falcon 管 VWR 470225-000 25 mL 血清学 Fisher Scientific 公司 14955235 碳酸氢铵 （ABC） 赛默飞世尔科技 编号 A643-500 丙酮 西格玛·奥尔德里奇 34850-1升 BSA 检测试剂盒 VWR CA62408-940 离心机 5810 R 西格玛·奥尔德里奇 EP022628188 二硫苏糖醇 （DTT） 赛默飞世尔科技 编号 R0861 准备 1M DTT 等分试样原液并储存在 -20°C 胎牛血清 （FBS） 赛默飞世尔科技 12483020 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 加热块 HEPES 系列 西格玛·奥尔德里奇 H3375 制备 8M 尿素/40M HEPES 等分试样，储存在 -20 °C 碘乙酰胺 （IAA） Fisher Scientific 公司 AAA1471514 准备 0.55M IAA 等分试样储备液并储存在 -20°C 下。避免光照 L-谷氨酰胺 Fisher Scientific 公司 25030081 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 液氮 LoBind 微量离心管 Eppendorf 埃本多夫 电话:13-698-794 青霉素、链霉素、两性霉素 西格玛·奥尔德里奇 编号 A5955 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 中性粒细胞分化的 HL60 细胞 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 生物商店 PBS408 系列 在室温下储存 探头超声仪 Fisher Scientific 公司 100-132-894 蛋白酶抑制剂混合物 （PIC） 片剂 西格玛·奥尔德里奇 5892791001 在 4°C 下储存 RPMI 1640 系列 赛默飞世尔科技 11875093 在 4°C 下储存 十二烷基硫酸钠 （SDS） 赛默飞世尔科技 J18220 号。答 1 制备 2% SDS 溶液 SpeedVac 离心机 Eppendorf 埃本多夫 07-748-15 T75 培养瓶 赛默飞世尔科技 156499 盐酸 Tris pH 值 8.5 Fisher Scientific 公司 BP152-1型 在 4°C 下储存 超声波浴 VWR 编号 97043-960 尿素 生物商店 URE001.1