用于多肽脱盐和纯化的 STAGE Tip 程序

1. 肽的纯化和脱盐

1. 对于每个肽样品，在 200 μl 移液器吸头中填充三层 C18 树脂，以构建 STop And Go Extraction （STAGE） 吸头。
2. 向样品中加入 1/10 终止液（20% 乙腈 [ACN]] 和 6% 三氟乙酸 [TFA]）。
3. 以 13,200 rpm 离心样品沉淀沉淀 10 分钟。
4. 将上清液转移到新的 2 mL 试管中，弃去沉淀。
5. 用 100 μl 100% ACN 洗涤阶段尖端。
6. 以 1000 x g 离心 STAGE 吸头 2 分钟
   注意: 离心 STAGE 吸头，直到所有液体都流过 C18 填料。
7. 用 50 μl 缓冲液 B（80% 乙腈、0.5% 乙酸和 ddH₂O）洗涤 STAGE 吸头。
8. 以 1000 x g 离心 STAGE 吸头 2 分钟。
9. 用 200 μl 缓冲液 A（2% ACN、0.1% TFA、0.5% 乙酸和 ddH₂O）洗涤 STAGE 吸头。
10. 以 1000 x g 离心载物台吸头 2 分钟。
11. 将样品加载到 STAGE 吸头中。
12. 以 1000 x g 离心样品 3-5 分钟。
13. 用 200 μl 缓冲液 A 洗涤 STAGE 吸头。
14. 以 1000 x g 离心 3-5 分钟。
15. 在每个 STAGE 吸头中加入 50 μl 缓冲液 B
16. 使用注射器将含有缓冲液 B 的样品洗脱到 0.2 mL PCR 联管中。
17. 洗脱样品后，使用真空离心机干燥肽 45 分钟。
18. 样品干燥后，将其储存在室温下，直到 MS.
    注意:如果需要储存肽超过两周，我们建议在 -20°C 下储存。
19. 在高分辨率质谱 （MS） 上运行样品><。 注意: 样品测量参数（例如，样品上样量、液相色谱梯度长度、分离度）将取决于所使用的仪器。

2. 中性粒细胞的蛋白质组学分析

1. 原始数据处理
   1. 将从 MS 获得的原始数据文件上传到 MaxQuant。
   2. 该软件设计为使用自下而上、数据依赖的采集文件运行，并且许多默认参数都针对此类样品进行了优化。默认参数包括消化 （胰蛋白酶 P）、蛋氨酸氧化的可变修饰 （氧化 （M）） 和蛋白质的 N-乙酰化 （乙酰基 （蛋白质 N 端）） 以及半胱氨酸的氨基甲基化的固定修饰 （carbamidomethyl （C））。
   3. 对这些参数的调整包括无标记定量（LFQ;将最小比率计数设置为 1）、运行之间匹配（即开/关）以及每个蛋白质鉴定的最小肽数（建议设置为 2）。
   4. 在全局参数中，导入 FASTA 文件以进行序列标识。在这个实验中，使用了来自 Uniprot 数据库的 Homo sapiens （Human） （UP000005640） FASTA 文件。注意:记录以下信息以保存记录:生物体 ID = 9606;蛋白质的数量 = 79,740;文件下载日期。
   5. 设置要用于处理的计算机内核数，然后选择 Start（启动）。
   6. 完成 MaxQuant 后，将生成一个"组合"文件夹以及其他文件。
      注意:其他文件可用于识别肽段、修饰等，并且可能需要将完整数据集上传到数据存储库，包括 Proteome Xchange （PRIDE）。
2. Perseus 中的数据分析和可视化
   1. 将"proteingroups.txt"上传到 Perseus 中，并为"主"窗口选择所有 LFQ 强度文件。
      注意:基线信息直接导入 Perseus 窗口，但其他信息（例如，修饰位点）可能需要手动添加。
   2. 通过去除污染物、反向肽和仅按位点鉴定的肽来过滤行。
   3. 通过 log₂（x） 转换数据。
   4. 要观察每个重复中检测到的蛋白质数量，请构建一个数字维恩图。
   5. 为每个样本设置分类注释。
      注意: 出于统计目的，一个生物样品的所有重复应具有相同的名称。
   6. 根据有效值过滤行，在 >50% 的重复中鉴定出蛋白质，并且至少在一个组中鉴定出><蛋白质。 注意: 根据实验设置和目标（例如，所有样品中都必须存在蛋白质），按有效值进行过滤可能更加严格。
   7. 要替换 LFQ 的缺失值，可以执行正态分布的插补。
      注意:默认参数针对 LFQ 数据进行了优化，但可以根据需要进行调整。
   8. 将注释信息添加到蛋白质行。将txt.gz FASTA 文件（从 Perseus 网站获得）添加到 'bin'、'conf' 和 'annotation' 文件夹中，并引入特定术语（例如，蛋白质名称、基因名称、基因本体）。
   9. 该基质现已完成，可用于统计测试（例如，方差分析、t 检验），以确定测试条件之间蛋白质丰度的显著变化。其他形式的可视化工具包括主成分分析图、热图和类别丰富。
      注意:注释信息也可以从 UniProt 下载并集成到 Perseus 框架中。