一种用于肽段脱盐与纯化的STAGE Tip操作流程

摘要

来源：
Tia Rizakos¹, Jennifer Geddes-McAlister<sup>1

1</sup>圭尔夫大学分子与细胞生物学系。

本视频演示了通过STAGE Tip方法进行肽段纯化的过程。该方法使用一种微型色谱柱，其内含有与长链烃基共价结合的树脂珠，可实现基于疏水相互作用的纯化。将预先消化的肽段样品上样至色谱柱后，肽段片段会结合到树脂珠上，而杂质则被洗脱通过。随后使用能够破坏疏水相互作用的洗脱缓冲液，将肽段片段洗脱下来。

方案

1. 肽的纯化与脱盐

1. 为每个肽样品在200 μl移液枪头中填充三层C18树脂，以构建STop And Go Extraction（STAGE）小柱。
2. 向样品中加入1/10体积的终止溶液（20%乙腈[ACN]和6%三氟乙酸[TFA]）。
3. 以13,200 rpm离心10分钟，使沉淀物沉淀。
4. 将上清液转移至新的2 mL离心管中，并弃去沉淀物。
5. 用100 μl 100%乙腈（ACN）洗涤STAGE小柱。
6. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
   注意：离心STAGE小柱直至所有液体通过C18树脂。
7. 用50 μl缓冲液B（80%乙腈、0.5%乙酸和ddH₂O）洗涤STAGE小柱。
8. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
9. 用200 μl缓冲液A（2%乙腈、0.1% TFA、0.5%乙酸和ddH₂O）洗涤STAGE小柱。
10. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
11. 将样品加载至STAGE小柱中。
12. 以1000 × g离心样品3–5分钟。
13. 用200 μl缓冲液A洗涤STAGE小柱。<....

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 15 ml Falcon 管 VWR 470225-000 25 mL 血清学 Fisher Scientific 公司 14955235 碳酸氢铵 （ABC） 赛默飞世尔科技 编号 A643-500 醋酸 西格玛·奥尔德里奇 1099510001 丙酮 西格玛·奥尔德里奇 34850-1升 乙腈 （ACN），MS 级 刺 TS-51101 系列 BSA 检测试剂盒 VWR CA62408-940 C18 圆盘（STAGE 吸头） Fisher Scientific 公司 13110019 离心机 5810 R 西格玛·奥尔德里奇 EP022628188 二硫苏糖醇 （DTT） 赛默飞世尔科技 编号 R0861 准备 1M DTT 等分试样原液并储存在 -20°C 胎牛血清 （FBS） 赛默飞世尔科技 12483020 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 HEPES 系列 西格玛·奥尔德里奇 H3375 制备 8M 尿素/40M HEPES 等分试样，储存在 -20 °C 高分辨率质谱仪 赛默飞世尔科技 726042 碘乙酰胺 （IAA） Fisher Scientific 公司 AAA1471514 准备 0.55M IAA 等分试样储备液并储存在 -20°C 下。避免光照 L-谷氨酰胺 Fisher Scientific 公司 25030081 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 LoBind 微量离心管 Eppendorf 埃本多夫 电话:13-698-794 MaxQuant 量子 https://www.maxquant.org/ PCR 联排管 VWR 76318-802 青霉素、链霉素、两性霉素 西格玛·奥尔德里奇 编号 A5955 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 英仙座 https://www.maxquant.org/Perseus/ 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 生物商店 PBS408 系列 在室温下储存 探头超声仪 Fisher Scientific 公司 100-132-894 蛋白酶抑制剂混合物 （PIC） 片剂 西格玛·奥尔德里奇 5892791001 在 4°C 下储存 RPMI 1640 系列 赛默飞世尔科技 11875093 在 4°C 下储存 十二烷基硫酸钠 （SDS） 赛默飞世尔科技 J18220 号。答 1 制备 2% SDS 溶液 SpeedVac 离心机 Eppendorf 埃本多夫 07-748-15 STAGE 倾倒离心机 声音 STC-V2 系列 T75 培养瓶 赛默飞世尔科技 156499 三氟乙酸 赛默飞世尔科技 85183 盐酸 Tris pH 值 8.5 Fisher Scientific 公司 BP152-1型 在 4°C 下储存 胰蛋白酶/LysC 赛默飞世尔科技 编号 A40009 分装并储存在 -20°C 超声波浴 VWR 编号 97043-960 尿素 生物商店 URE001.1