一种用于肽段脱盐与纯化的STAGE Tip操作流程

摘要

来源：
Tia Rizakos¹, Jennifer Geddes-McAlister<sup>1

1</sup>圭尔夫大学分子与细胞生物学系。

本视频演示了通过STAGE Tip方法进行肽段纯化的过程。该方法使用一种微型色谱柱，其内含有与长链烃基共价结合的树脂珠，可实现基于疏水相互作用的纯化。将预先消化的肽段样品上样至色谱柱后，肽段片段会结合到树脂珠上，而杂质则被洗脱通过。随后使用能够破坏疏水相互作用的洗脱缓冲液，将肽段片段洗脱下来。

方案

1. 肽的纯化与脱盐

1. 为每个肽样品在200 μl移液枪头中填充三层C18树脂，以构建STop And Go Extraction（STAGE）小柱。
2. 向样品中加入1/10体积的终止溶液（20%乙腈[ACN]和6%三氟乙酸[TFA]）。
3. 以13,200 rpm离心10分钟，使沉淀物沉淀。
4. 将上清液转移至新的2 mL离心管中，并弃去沉淀物。
5. 用100 μl 100%乙腈（ACN）洗涤STAGE小柱。
6. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
   注意：离心STAGE小柱直至所有液体通过C18树脂。
7. 用50 μl缓冲液B（80%乙腈、0.5%乙酸和ddH₂O）洗涤STAGE小柱。
8. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
9. 用200 μl缓冲液A（2%乙腈、0.1% TFA、0.5%乙酸和ddH₂O）洗涤STAGE小柱。
10. 以1000 × g离心STAGE小柱2分钟。
11. 将样品加载至STAGE小柱中。
12. 以1000 × g离心样品3–5分钟。
13. 用200 μl缓冲液A洗涤STAGE小柱。
14. 以1000 × g离心3–5分钟。
15. 向每个STAGE小柱中加入50 μl缓冲液B。
16. 使用注射器将含有缓冲液B的样品洗脱至0.2 mL PCR条形管中。
17. 样品洗脱后，使用真空离心浓缩仪干燥肽段45分钟。
18. 样品干燥后，于室温下保存至质谱分析。
    注意：若需保存肽段超过两周，建议在-20°C下保存。
19. 使用高分辨率质谱仪（MS）检测样品。
    注意：样品检测参数（如上样量、液相色谱梯度长度、分辨率等）取决于所使用的仪器设备。

2. 中性粒细胞的蛋白质组学分析 

1. 原始数据处理
   1. 将从质谱仪（MS）获得的原始数据文件上传至 MaxQuant。
   2. 该软件专为自下而上（bottom-up）、数据依赖性采集（data-dependent acquisition）模式的文件设计，许多默认参数已针对此类样本进行了优化。默认参数包括酶解方式（胰蛋白酶 P，Trypsin P）、可变修饰（甲硫氨酸氧化（oxidation (M)）和蛋白质 N 端乙酰化（Acetyl (Protein N-term)）），以及半胱氨酸的固定修饰（羧氨甲基化（carbamidomethyl (C)））。
   3. 这些参数的调整包括：进行非标记定量（LFQ；建议将最小比值计数设为 1）、运行间匹配（Match Between Runs，可选择开启或关闭），以及每种蛋白质鉴定出的最少肽段数量（建议设置为 2）。
   4. 在全局参数中，导入用于序列鉴定的 FASTA 文件。本实验使用了 UniProt 数据库中的 Homo sapiens（人）（UP000005640）FASTA 文件。注意：请记录以下信息以备存档：物种 ID = 9606；蛋白质数量 = 79,740；文件下载日期。
   5. 设置用于数据处理的计算机核心数量，然后选择“开始”。
   6. MaxQuant 运行完成后，将生成一个“combined”文件夹及其他相关文件。
      注意：其他文件可用于鉴定肽段、修饰位点等信息，也可能需要上传至数据存储库（如 ProteomeXchange（PRIDE））以提交完整数据集。
2. 在 Perseus 中进行数据分析与可视化
   1. 将“proteingroups.txt”文件导入 Perseus，并在“Main”窗口中选择所有 LFQ 强度文件。
      注意：基线信息会直接导入 Perseus 窗口，但其他信息（例如修饰位点）可能需要手动添加。
   2. 通过移除污染物、反向肽段以及仅通过位点鉴定的肽段来过滤行数据。
   3. 对数据进行 log₂(x) 转换。
   4. 为观察每个重复样本中检测到的蛋白质数量，构建数值型维恩图（numeric Venn diagram）。
   5. 为每个样本设置分类注释。
      注意：出于统计分析目的，同一生物样本的所有技术或生物重复应使用相同名称。
   6. 根据有效值对行数据进行过滤，要求蛋白质在至少一个组内被鉴定，且在>50% 的重复样本中具有有效值。
      注意：有效值的过滤标准可根据实验设计和研究目标进一步严格化（例如，要求蛋白质在所有样本中均被检测到）。
   7. 为填补 LFQ 数据中的缺失值，可采用基于正态分布的插补法（imputation from the normal distribution）。
      ​注意：默认参数已针对 LFQ 数据优化，但可根据需要进行调整。
   8. 为蛋白质行添加注释信息。将从 Perseus 官网获取的 txt.gz 格式 FASTA 文件添加至“bin”、“conf”和“annotation”文件夹中，并导入特定注释项（如蛋白质名称、基因名称、基因本体（gene ontology）等）。
   9. 此时数据矩阵已构建完成，可用于统计检验（如 ANOVA、t 检验），以确定不同实验条件下蛋白质丰度的显著变化。其他可视化工具包括主成分分析图（PCA）、热图（heat maps）和功能类别富集分析。
      注意：注释信息也可从 UniProt 下载并整合至 Perseus 分析框架中。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 15 ml Falcon 管 VWR 470225-000 25 mL 血清学 Fisher Scientific 公司 14955235 碳酸氢铵 （ABC） 赛默飞世尔科技 编号 A643-500 醋酸 西格玛·奥尔德里奇 1099510001 丙酮 西格玛·奥尔德里奇 34850-1升 乙腈 （ACN），MS 级 刺 TS-51101 系列 BSA 检测试剂盒 VWR CA62408-940 C18 圆盘（STAGE 吸头） Fisher Scientific 公司 13110019 离心机 5810 R 西格玛·奥尔德里奇 EP022628188 二硫苏糖醇 （DTT） 赛默飞世尔科技 编号 R0861 准备 1M DTT 等分试样原液并储存在 -20°C 胎牛血清 （FBS） 赛默飞世尔科技 12483020 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 HEPES 系列 西格玛·奥尔德里奇 H3375 制备 8M 尿素/40M HEPES 等分试样，储存在 -20 °C 高分辨率质谱仪 赛默飞世尔科技 726042 碘乙酰胺 （IAA） Fisher Scientific 公司 AAA1471514 准备 0.55M IAA 等分试样储备液并储存在 -20°C 下。避免光照 L-谷氨酰胺 Fisher Scientific 公司 25030081 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 LoBind 微量离心管 Eppendorf 埃本多夫 电话:13-698-794 MaxQuant 量子 https://www.maxquant.org/ PCR 联排管 VWR 76318-802 青霉素、链霉素、两性霉素 西格玛·奥尔德里奇 编号 A5955 解冻，准备等分试样并储存在 -20°C 下 英仙座 https://www.maxquant.org/Perseus/ 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 生物商店 PBS408 系列 在室温下储存 探头超声仪 Fisher Scientific 公司 100-132-894 蛋白酶抑制剂混合物 （PIC） 片剂 西格玛·奥尔德里奇 5892791001 在 4°C 下储存 RPMI 1640 系列 赛默飞世尔科技 11875093 在 4°C 下储存 十二烷基硫酸钠 （SDS） 赛默飞世尔科技 J18220 号。答 1 制备 2% SDS 溶液 SpeedVac 离心机 Eppendorf 埃本多夫 07-748-15 STAGE 倾倒离心机 声音 STC-V2 系列 T75 培养瓶 赛默飞世尔科技 156499 三氟乙酸 赛默飞世尔科技 85183 盐酸 Tris pH 值 8.5 Fisher Scientific 公司 BP152-1型 在 4°C 下储存 胰蛋白酶/LysC 赛默飞世尔科技 编号 A40009 分装并储存在 -20°C 超声波浴 VWR 编号 97043-960 尿素 生物商店 URE001.1