评估功能性SARS-CoV-2中和抗体

摘要

来源：
Kelly Da Costa¹, Diego Cantoni^1,2, Martin Mayora-Neto¹, Tobia Fantoni^1,3, Nigel Temperton<sup>1

1</sup>肯特大学梅德韦药学院，病毒假型单元。

²格拉斯哥大学MRC-病毒研究中心，格拉斯哥大学。

³维罗纳大学神经科学、生物医学与运动科学系。

本视频展示了一种中和试验，用于检测血清在中和SARS-CoV-2病毒方面的有效性。该方法涉及假病毒、血清稀释以及基于发光信号的定量分析，以确定中和滴度。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 基于假型病毒的中和实验

注意pMN 是指通过含抗 SARS-CoV-2 刺突蛋白抗体的人类康复期血清样本抑制假型病毒（PV）介导的转导.

1. 使用多通道移液器，在96孔白色板中向B至H行、1至12列的各孔加入50 µl的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）。
2. 在A行2至10列的孔中加入5 µl康复期血清，总体积为100 µl DMEM/10% FBS/1% P/S。在A11和A12孔中分别加入已知量（例如5 µl）的阳性抗血清（NIBSC 20/162校准品、HICC-pool 2或HICC pool 3）和阴性抗血清（2019年前采集的患者血清）作为对照。
3. 从A行各孔中移除50 µl，并向下对下方所有孔进行两倍系列稀释。
4. 每次稀释时，使用多通道移液器通过反复吹打5–10次充分混匀，注意避免产生气泡。
5. 完成系列稀释后，应弃去每列最后一个孔中的最终50 µl。
   注意：此时，每个孔应含有50 µl混合的DMEM以及患者血清或对照血清的系列稀释液。
6. 将板在500 rpm下离心1分钟，以确保孔壁上无残留液体。
7. 根据假病毒滴定获得的数据，计算所需DMEM体积，用于稀释SARS-CoV-2假病毒（PV），以在50 µl中获得5 × 10⁶ RLU，总体积为5 ml。
8. 使用多通道移液器在移液槽中混匀该稀释后的PV溶液，并将50 µl分装至板中每个孔，A6至A12孔除外（仅细胞对照）。A1至A6孔将作为仅PV对照。
9. 将板在500 rpm下离心1分钟，以确保孔壁上无残留病毒。
10. 将板在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育1小时，使血清有足够时间结合SARS-CoV-2糖蛋白。
11. 准备一块转染了血管紧张素转换酶2（ACE2）表达质粒和跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）表达质粒、且已培养24小时的HEK 293T/17靶细胞板。
    1. 移除板中的培养基。
    2. 沿培养皿一侧用2 ml PBS洗涤两次，避免细胞脱落，然后弃去PBS。
    3. 向板中加入2 ml胰蛋白酶，并将板放入孵育箱直至细胞脱落。
    4. 细胞脱落后，向板中加入6 ml DMEM/10% FBS/1%青霉素/链霉素以终止胰蛋白酶活性，并轻柔重悬细胞。
    5. 使用TC20^TM自动细胞计数仪或计数板进行细胞计数，并将1 × 10⁴个细胞以总体积50 µl加入每个孔中。
12. 将板在37 °C、5% CO₂条件下孵育48–72小时。
13. 使用GloMax® Navigator微孔板发光仪配合Bright Glo^TM荧光素酶检测试剂系统读取板：从所有孔中移除培养基，每孔加入25 µl PBS与Bright Glo^TM荧光素酶检测试剂按1:1比例配制的混合液。
14. 根据发光仪提供的原始数据，采用既定方案计算半最大抑制浓度（IC50）中和抗体滴度。IC50值低于1:40稀释倍数的视为阴性。也可选择使用AutoPlate软件进行数据分析。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 MultiGuard Barrier 移液器吸头 1-20 μl 索伦森生物科学 30550吨 MultiGuard Barrier 移液器吸头 1-200 μl 索伦森生物科学 30550吨 Nunc TM 细胞培养皿 Delta 表面处理（10 cm 无菌培养皿） 赛默飞世尔科技 150350 移液器盆 （50 ml） 通用 96 孔白板 赛默飞世尔科技 136101 HEK 293T/17 细胞 ATCC 编号 CRL-11268 宿主细胞进入受体血管紧张素转换酶 2 （ACE2） 表达质粒:pCDNA3.1+-ACE2 西蒙斯 2004 冠状病毒刺突 （S） 蛋白引发跨膜丝氨酸蛋白酶 2 （TMPRSS2） 表达质粒:pCAGGS-TMPRSS2 Bertram 2010 年 含 4.5 g/L 葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S） 泛生科技 P04-04510
P40-37500
货号 P06-07100 FuGENE® HD 转染试剂，1 ml 普罗梅加 编号 E2311 胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红 泛生科技 货号 P10-040100 可中和 SARS-CoV-2 PV 的阳性对照抗体（抗 SARS-CoV-2 抗体研究试剂）（NIBSC，代码:20/162，国际上有售或 HICC-pool 2/HICC pool 3） 检测 COVID-19 人类恢复期血浆 Bright Glo 荧光素酶检测系统 普罗梅加 E2650 系列