从小鼠模型中分离不变的自然杀伤T细胞

摘要

来源：Meng, M., 等 葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中iNKT细胞的过继免疫治疗 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种分离不变的自然杀伤T细胞（即iNKT细胞）的方法。该实验首先向小鼠体内注射一种合成糖脂，以刺激脾脏中iNKT细胞的活化与增殖。随后，制备脾脏的单细胞悬液，并与带有荧光标记、可被iNKT细胞识别的复合物共同孵育，再通过磁珠分选法分离出iNKT细胞。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 通过过继性细胞治疗获得不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）

1. iNKT细胞的定向诱导
   1. 向正常小鼠腹腔注射 α-半乳糖基神经酰胺（α-GalCer），剂量为每公斤体重 0.1 mg。
2. iNKT细胞的分离
   1. 建模后第3天，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。充分麻醉的小鼠在脚趾受夹时不会出现后肢回缩反应。
   2. 在向 DBA/1 小鼠腹腔注射 α-GalCer 后，分离其脾脏。通过在 200 目筛网上剪切并研磨脾脏，制备单细胞悬液。
   3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞悬液，200 × g 离心 g 5 分钟，弃去上清液。重复一次。
   4. 用1 mL全血和组织稀释液重悬细胞。加入3 mL小鼠淋巴细胞分离液，然后以300 x g离心20分钟 g 在室温下
   5. 收集乳白色淋巴细胞层（即从上往下数第二层），用PBS洗涤2次，并使用自动细胞计数仪进行计数。
3. 磁珠激活细胞分选（MACS）阳性选择法用于纯化iNKT细胞
   注意： CD1d 四聚体的预处理方法如下：将浓度为 1 mg/mL 的 α-Galcer 用含 0.5% Tween-20 和 0.9% NaCl 的溶液稀释至 200 μg/mL，取 5 µL 该稀释液加入 100 µL CD1d 四聚体溶液中，混合物于室温孵育 12 小时，随后置于 4 °C 保存备用。T 细胞受体（TCR）β 使用去离子水稀释 80 倍。其余抗体均以原液浓度使用。
   1. 重悬 10⁷ 用100 µL 4 °C的PBS重悬细胞，加入10 µL负载α-GalCer的CD1d四聚体-藻红蛋白 （CD1d 四聚体-PE），在避光条件下于 4 °C 孵育 15 分钟。
   2. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，然后将细胞重悬于 80 µL PBS 中。
   3. 加入20 µL抗PE-MicroBeads，在4 °C避光孵育20分钟。
   4. 用 PBS 洗涤两次，然后将细胞重悬于 500 µL PBS 中。
   5. 将分选柱置于MACS分选仪的磁场中，并用500 µL PBS冲洗。
   6. 将1.3.4步骤中的细胞悬液加入分选柱，收集穿流液，并用PBS缓冲液洗涤3次。
   7. 移除磁场，从分选柱中收集细胞。此时，向分选柱中加入1 mL PBS缓冲液，并以恒定压力快速推动活塞，将标记的细胞洗脱至收集管中，获得纯化的iNKT细胞。使用自动细胞计数器进行计数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	德国
层析柱	Miltenyi	MS	德国
冷冻离心机	Beckman	Allegra® X-15R	美国
小鼠 CD1d 四聚体-PE	MBL	TS-MCD-1	日本
小鼠 Percoll	Solarbio	P8620	中国
光学显微镜	Olympus	Olympus-II	日本