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使用修饰mRNA转染原代巨噬细胞

2025年7月8日

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源：Herb, M. 等，利用体外转录mRNA高效转染原代巨噬细胞。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用编码绿色荧光蛋白的修饰mRNA转染原代巨噬细胞的过程。这些经过修饰的mRNA旨在降低免疫原性并提高其稳定性，从而确保成功转染及后续绿色荧光蛋白的表达，转染效果通过荧光显微镜观察确认。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意： 所有操作步骤均需佩戴手套。所有转染步骤均须在层流罩内进行，以防止细胞污染。在使用 mRNA 前，须用 70% 乙醇和/或可降解 RNA 酶的表面活性剂清洁所有仪器（如移液器）及工作台面（材料表）。确保所有反应管无 RNA 酶且无菌。稀释时仅使用无菌、无 RNA 酶的水。移液枪头必须使用带滤芯的类型，并且每次移液后均需更换新枪头。

1. DNA模板的制备

注意： 用于 体外 使用本方案进行 mRNA 转录时，必须包含 T7 启动子序列，以允许 RNA 聚合酶结合。若含有目的蛋白 DNA 序列的质粒已在目的序列正上游包含正确方向的 T7 启动子序列，则需对质粒进行线性化处理（见步骤 1.1）。否则，需通过聚合酶链式反应（PCR，见步骤 1.2）将 T7 启动子连接至目的序列。

  1. 含有T7启动子的质粒线性化
    1. 使用限制性内切酶对已含有正确方向T7启动子序列的质粒进行酶切，酶切位点应位于目的序列终止密码子的下游，以实现质粒的线性化。否则，转录将无法在目的序列之后正确终止。
      注意： 建议使用产生平末端或5'突出末端的限制性内切酶。
    2. 通过琼脂糖凝胶电泳比较酶切前后质粒DNA的迁移情况，确认质粒是否完全线性化。
    3. 在将线性化质粒DNA用作体外mRNA转录的DNA模板之前，使用DNA纯化试剂盒（材料表）对其进行纯化。
  2. 通过PCR连接T7启动子
    1. 设计上游引物，其序列应包含以下组分（从5'到3'方向依次排列）：启动子上游约5个随机碱基（例如GAAAT）；T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAG）；为提高转录效率而添加的两个额外G碱基（GG）；一段与起始密码子周围质粒序列同源的目标序列特异性区域。
      注意： 该同源部分应包括Kozak序列和起始密码子上游3-6个碱基、Kozak序列及起始密码子（通常为GCCACC ATG G），以及起始密码子下游12-18个碱基。如果目的序列本身不含有Kozak序列或起始密码子，可在本步骤中通过在引物序列中直接加入这些元件来实现添加。
    2. 仅根据与目标序列同源的部分计算上游引物的tm 值。
    3. 为评估引物二聚体或发夹结构的形成，应使用完整的引物序列进行分析，该序列长度可能轻松超过50个碱基。
    4. 使用一个位于终止密码子下游某位置的下游引物。
      注意： 如果目的序列本身不含有终止密码子，可在本步骤中通过在下游引物序列中直接包含终止密码子来实现添加。
    5. 使用上述上游和下游引物，采用具有校对功能的高保真DNA聚合酶（材料表）进行PCR扩增。
    6. 通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物为单一扩增条带，并验证扩增片段大小（例如，使用1%琼脂糖凝胶，恒定电流100 V）。
    7. 在将PCR产物用作体外信使核糖核酸（mRNA）转录的脱氧核糖核酸（DNA）模板之前，使用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。

2. mRNA 的合成

  1. 解冻体外 mRNA 转录试剂盒的所有组分（参见 材料列表。涡旋5秒，然后在2,000 x g下离心2秒 g保持在冰上直至使用。
  2. 在0.5 mL微量离心管中按以下顺序配制体外mRNA转录反应体系（总体积40 µL）：20 µL 10x抗反向加帽类似物/核苷三磷酸（ARCA/NTP）混合液（包含于试剂盒中） 体外 mRNA转录试剂盒）；0.25 µL 5-甲基胞苷三磷酸（5-mCTP）（终浓度为1.25 mM，占总CTP的50%）；0.25 µL 假尿苷三磷酸（pseudo-UTP）（终浓度为1.25 mM，占总UTP的50%）；X µL DNA模板；2 µL T7 RNA聚合酶混合液（包含在体外mRNA转录试剂盒中）；Y µL无RNase的H₂O2O.     
    注意： X 是含有至少 1 µg DNA 的体积。例如，从 625 ng/µL 的储备液中取 1.6 µL。Y 是补足至总体积 40 µL 所需的额外体积。
  3. 涡旋5秒，然后在2,000 x g下离心2秒 g37 °C 下，在恒温混匀仪中以 400 rpm 转速孵育 30 分钟，进行体外转录。
  4. 然后，向反应混合物中直接加入 2 µL DNase I，以去除模板 DNA。涡旋振荡 5 秒，随后在 2,000 x g 条件下离心 2 秒 g.
  5. 在37 °C、400 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育15分钟。取2 µL用于对照凝胶（步骤3.3），其余样品于-80 °C保存。
  6. 进行 poly(A) 尾添加时，将以下组分直接加入上一步反应混合物中（终体积为 50 µL）：5 µL 10x poly(A) 聚合酶反应缓冲液和 5 µL poly(A) 聚合酶（均来自体外 mRNA 转录试剂盒）。涡旋振荡 5 秒，然后在 2,000 x g 条件下离心 2 秒。 g.
  7. 在37 °C、400 rpm条件下，于恒温混匀仪中孵育反应体系30分钟。取2 µL样品用于对照凝胶检测（步骤3.3），其余样品储存于-80 °C。
  8. 为去除mRNA 5´端的磷酸基团，将以下组分直接加入上一步反应混合物中（终体积为60 µL）：3 µL无RNase的H2O；6 µL 10x Antarctic 磷酸酶反应缓冲液；3 µL Antarctic 磷酸酶（15 单位，用于 60 µL 反应体系）。涡旋混匀 5 秒，2,000 x g 离心 2 秒。 g.
  9. 在37 °C、400 rpm条件下，于恒温混匀仪中孵育混合物30分钟。
  10. 80 °C孵育2分钟以热失活南极磷脂酶。
    注意： 理想情况下，应使用单独的恒温混匀仪，不要等到第一台混匀仪达到设定温度。

3. mRNA 纯化

  1. 纯化 体外 使用专用RNA纯化试剂盒提取的转录mRNA（材料表).
    1. 向步骤2.10的mRNA反应混合物中加入X µL洗脱液。轻轻翻转混匀5次。加入300 µL结合溶液浓缩液，再用移液器轻柔吹打混匀5次。    
      注意： X 是指补足至总体积 100 µL 所需的额外体积。例如，向 60 µL mRNA 反应混合液中加入 40 µL 洗脱液。
    2. 加入100 µL无RNA酶的乙醇。轻柔吹打混匀5次。
    3. 将过滤柱放入提供的收集管中。将 mRNA 反应混合液轻柔地转移至过滤柱中心，避免接触滤膜。在 15,000 x g 室温（RT）下孵育1分钟。
    4. 小心提起滤柱，弃去收集管中的流穿液，将滤柱放回原来的收集管中。
    5. 加入500 µL洗涤液（首次使用前切记加入20 mL无RNA酶的乙醇）。
    6. 在 15,000 x g 条件下离心 g 室温下孵育1分钟。重复步骤3.1.4-3.1.6再洗涤一次。
    7. 以最高速度离心（17,900 x g在室温下离心1分钟以去除滤柱中残留的液体。小心地将滤柱从收集管中取出，放入新的收集管中。
    8. 将50 µL洗脱缓冲液加入滤膜中央，避免接触滤膜。在65 °C条件下于恒温混匀仪中孵育10分钟。
    9. 在室温下以15,000 × g离心1分钟。移除滤柱并弃去。
  2. 使用微量分光光度计在260 nm和280 nm处测定吸光度，以评估洗脱mRNA的浓度和纯度。
    注意： A260/A280 比值在 1.8–2.1 之间表明 mRNA 纯度较高。
  3. 通过在变性条件下对步骤 2.5 和 2.7 的等分试样进行琼脂糖凝胶电泳，验证单一产物的存在、转录本长度的正确性以及 poly(A) 加尾情况（例如，使用含有 20 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸 [MOPS]、5 mM 醋酸钠、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 20% 甲醛的 1.2% 琼脂糖凝胶，并在含 20 mM MOPS、5 mM 醋酸钠、1 mM EDTA 和 0.74% 甲醛的缓冲液中以 100 V 恒定电流电泳）。
  4. 将纯化的mRNA保存在洗脱管中，置于-80 °C直至转染。若转染时仅使用少量mRNA，则应将mRNA分装保存，以避免反复冻融。   
    注意： mRNA 可在 -80 °C 下保存约 1 年。

4. 巨噬细胞制备

  1. 通过颈椎脱位法处死 C57/BL6 小鼠（使用相同性别且年龄为 6-24 周的小鼠）。
    注意： 同一批小鼠可用于分离原代巨噬细胞（PM）（步骤 4.2）以及生成骨髓来源巨噬细胞（BMDM）（步骤 4.3 和 4.4）。用于分离 PM 时至少需要两只小鼠；若仅用于生成 BMDM，通常一只小鼠已足够。
  2. 腹腔巨噬细胞的免疫磁珠富集。
    1. 用 8 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）和 2 mL 空气填充一支 10 mL 注射器并连接 0.9 x 40 mm 套管。用 PBS 冲洗腹腔。空气将形成气泡，以减少 PBS 泄漏。
    2. 用同一支注射器迅速收集腹腔灌洗液，并转移至 50 mL 圆锥形离心管中。如需，可合并多只小鼠的腹腔细胞。将细胞悬液置于冰上保存。
    3. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 的 0.2% NaCl 溶液中 30 秒，以裂解红细胞。
    4. 加入 5 mL 的 1.6% NaCl 溶液，使总体积达到 10 mL，以恢复等渗条件。在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每份腹腔灌洗液 97.5 µL 的磁珠细胞分选缓冲液（MCS 缓冲液，含 2 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA] 和 0.5% 牛血清白蛋白 [BSA] 的 PBS）中（例如，若冲洗了三只小鼠，则重悬于 292.5 µL 中）。
    6. 每 97.5 µL 细胞悬液中加入 2.5 µL 与 CD11b 特异性抗体偶联的顺磁性磁珠（例如，向 292.5 µL 中加入 7.5 µL）。
    7. 在 150 rpm 的旋转振荡器上冰浴孵育 15 分钟。
    8. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL MCS 缓冲液中。
    9. 加入 4 mL MCS 缓冲液，使总体积达到 5 mL，轻轻吹打混匀 3 次以洗涤细胞。
    10. 重复步骤 4.2.8 和 4.2.9 两次，共完成三次洗涤步骤。
    11. 在洗涤过程中，将 LS 柱置于磁性细胞分选器中（参见 材料表）。用 3 mL MCS 缓冲液冲洗柱子。
      注意： 避免产生气泡，因为气泡可能堵塞柱子。
    12. 将细胞沉淀重悬于 1 mL MCS 缓冲液中。加入 3 mL MCS 缓冲液，使总体积达到 4 mL，并通过吹打混匀 3 次。
    13. 将 4 mL 细胞悬液转移至已冲洗过的 LS 柱上。
      注意： 再次注意避免产生气泡，以免堵塞柱子。
    14. 等待柱子储液槽完全排空。在柱子停止滴液前不要添加额外液体。
    15. 向柱子中加入 3 mL MCS 缓冲液。等待储液槽完全排空后，重复步骤 4.2.15 两次。
    16. 将 LS 柱置于 15 mL 圆锥形离心管中。向柱子中加入 5 mL MCS 缓冲液。待 2 mL 液体流过柱子后，使用推杆轻轻推动剩余液体进入离心管。
    17. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    18. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 10% 热灭活胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（DMEM+FCS）中。
    19. 通过台盼蓝染色并在牛鲍计数板中计数，确定活细胞数量，并将细胞接种至含 DMEM+FCS 的培养板中。
      注意： 将 PM 以每孔 100,000 个细胞的密度接种于平底微孔板中。不要使用组织培养处理过的培养板，因为 PM 无法从这类板上脱落。应使用未处理的培养板。
  3. BMDM 的生成
    1. 使用剪刀去除后肢的皮肤和肌肉。将每条腿短暂浸入 70% 乙醇中进行清洗。
    2. 分离双腿，并用剪刀剪开股骨和胫骨的两端。
    3. 将 5 mL 极低内毒素 RPMI 1640 培养基装入一支 5 mL 注射器，并连接 0.6 mm x 30 mm 套管，冲洗已打开的骨骼，将骨髓冲出至培养皿中。
    4. 如需，可通过重复步骤 4.3.1–4.3.3 合并多只小鼠的骨髓。将骨髓转移至 50 mL 圆锥形离心管中。
    5. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    6. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 红细胞裂解缓冲液（8.3% 氯化铵 NH4Cl，0.1 M Tris）中，在室温下孵育 5 分钟以裂解红细胞。
    7. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    8. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 10% FCS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES、1% 丙酮酸钠和 10 ng/mL 重组巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的极低内毒素 RPMI 1640 培养基（RPMI+++++）中。
    9. 加入 4 mL RPMI+++++ ，使总体积达到 5 mL。
    10. 每只小鼠准备 5 个带凸缘的 92 mm x 16 mm 未处理培养皿（参见 材料表），每皿加入 7 mL RPMI+++++ 培养基。
    11. 将 1 mL 细胞悬液转移至 5 个已准备好的培养皿中，在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。
    12. 培养 4 天后，每皿加入 4 mL RPMI+++++ 补充培养基。6–7 天后，骨髓细胞将完全分化为 BMDM。
  4. BMDM 的收获
    1. 完全移除培养皿中的培养基。每皿加入 5 mL 温热的含 0.2 mM EDTA 的 PBS。
    2. 用细胞刮轻轻刮取整个培养皿以使 BMDM 脱落。将细胞悬液合并至 50 mL 圆锥形离心管中。
    3. 再次冲洗全部 5 个培养皿。对所有 5 个培养皿使用相同体积的 5 mL 温热含 0.2 mM EDTA 的 PBS。将此次获得的细胞悬液与前一步的悬液合并。
    4. 在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 10% FCS、1% HEPES、1% 丙酮酸钠和 10 ng/mL 重组 M-CSF 但不含抗生素的极低内毒素 RPMI 1640 培养基（RPMI++++）中。
    6. 通过台盼蓝染色并在牛鲍计数板中计数，确定活细胞数量，并将细胞接种至含 RPMI++++ 的培养板中。
      注意： 将 BMDM 接种于平底微孔板中，每孔最多 50,000 个细胞。不要使用组织培养处理过的培养板，因为 BMDM 很难从这类板上脱落。应使用未处理的培养板。

5. 巨噬细胞的mRNA转染

  1. 计算所需的mRNA转染缓冲液体积。 
    注意： 所需mRNA转染缓冲液的体积取决于孔的大小：6孔板每孔使用200 µL，12孔板每孔使用100 µL，依此类推。由于移液过程中的损失，应额外加入少量缓冲液（但不宜过多，以免导致mRNA过度稀释）。例如，在12孔板的4个孔中进行转染时，应使用450 µL，而不是4 × 100 µL = 400 µL。
  2. 计算所需的mRNA转染试剂体积。mRNA转染试剂的添加比例为1:50。例如，最终体积为450 µL时，需要9 µL的mRNA转染试剂。
  3. 计算所需的总mRNA量。为实现高效转染，每100,000个巨噬细胞至少需要100 ng mRNA，200 ng效果更佳（例如，转染400,000个巨噬细胞需要800 ng mRNA）。
    1. 将每个孔所需的mRNA量乘以需转染的总孔数（例如，4个孔，每孔含400,000个巨噬细胞：4 × 800 ng = 3,200 ng mRNA，共需3,200 ng）。例如，若您的mRNA原液浓度为426.8 ng/µL，则转染4个孔（每孔400,000个巨噬细胞）需要7.49 µL。
  4. 将计算好的mRNA转染缓冲液体积（步骤5.1）减去mRNA转染试剂体积（步骤5.2）和mRNA体积（步骤5.3）后，加入反应管中。例如，450 µL - 9 µL - 7.49 µL = 433.51 µL。
  5. 解冻mRNA原液，并通过轻轻翻转洗脱管混匀。将计算好的mRNA体积（步骤5.3）加入含有mRNA转染缓冲液的反应管中（以上述示例为例：在433.51 µL缓冲液中加入7.49 µL mRNA）。
  6. 涡旋振荡5秒，然后在2,000 × g下离心2秒。
  7. 将mRNA转染试剂涡旋振荡5秒，并在2,000 × g下离心2秒。
  8. 将计算好的mRNA转染试剂体积（步骤5.2）加入含有mRNA转染缓冲液和mRNA的反应管中（以上述示例为例：加入9 µL mRNA转染试剂）。
  9. 将转染混合物涡旋振荡5秒，然后在2,000 × g下离心2秒。
  10. 在室温下孵育15分钟。
  11. 在此期间，将巨噬细胞的培养基更换为新鲜的预温培养基（参见步骤4.2.18和4.4.5）。
  12. 完成步骤5.10的孵育后，将转染混合物以适合孔大小的体积（参见步骤5.1）逐滴加入含有巨噬细胞的孔中，加样时从孔的外周向中心呈环形滴加。
  13. 轻轻摇动培养板，先沿垂直方向、再沿水平方向晃动，以确保转染混合物在孔内均匀分布。随后在37 °C、5 % CO2条件下孵育。转染后不久，细胞将开始合成由转染mRNA编码的蛋白质。为获得最佳效果，建议孵育至少6小时。
  14. 孵育结束后，可通过（免疫）荧光显微镜、流式细胞术或免疫印迹法分析转染效率，或直接将转染后的巨噬细胞用于后续实验。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-甲基-CTP（100 mM）Jena BiosienceNU-1138S保存于 -20 °C
南极磷酸酶New England BioLabsM0289保存于 -20 °C
南极磷酸酶反应缓冲液（10X）New England BioLabsB0289保存于 -20 °C
抗-NEMO/IKKγ 抗体InvitrogenMA1-41046保存于 -20 °C
抗-β-肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA2228保存于 -20 °C
带卡槽的 92.16 mm 培养皿Sarstedt8,21,473保存于室温（RT）
CD11b 微珠（小鼠和人用）Miltenyi Biotec130-049-601保存于 4 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子正向引物Sigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3′，保存于 -20 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子反向引物Sigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′，保存于 -20 °C
DNA 纯化试剂盒：QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104保存于室温（RT）
eGFP + T7 启动子正向引物Sigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3′，保存于 -20 °C
eGFP + T7 启动子反向引物Sigma-Aldrich5′-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3′，保存于 -20 °C
快速消化缓冲液（10X）Thermo ScientificB64保存于 -20 °C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684保存于 -20 °C
高保真聚合酶（带校对功能）：Q5 高保真 DNA 聚合酶New England Biolabs IncM0491S保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子正向引物Sigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′，保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子反向引物Sigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′，保存于 -20 °C
in vitro mRNA 转录试剂盒：HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含 polyA 加尾）New England BioLabsE2060保存于 -20 °C
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401保存于室温（RT）
MACS 多功能支架Miltenyi Biotec130-042-303保存于室温（RT）
mRNA 转染缓冲液及试剂：jetMESSENGERPolyplus transfection409-0001DE保存于 4 °C
突变型 IKKβ IKK-2S177/181E 质粒Addgene11105保存于 -20 °C
突变型 NEMO C54/347A 质粒Addgene27268保存于 -20 °C
pEGFP-N3 质粒Addgene62043保存于 -20 °C
Poly(I:C)Calbiochem528906保存于 -20 °C
pPGK-Cre 质粒F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, 新型可诱导 Cre 重组酶：一种新型 Cre-PR 融合蛋白突变体表现出更高的敏感性和更广的可诱导范围。Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001)。保存于 -20 °C
假尿苷三磷酸（Pseudo-UTP，100 mM）Jena BiosienceNU-1139S保存于 -20 °C
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976保存于室温（RT）
大鼠抗小鼠 CD11b 抗体，APC 标记BioLegend101212保存于 4 °C
大鼠抗小鼠 F4/80 抗体，PE 标记eBioscience12-4801-82保存于 4 °C
重组 M-CSFPeprotech315-02保存于 -20 °C
RNA 纯化试剂盒：MEGAclear 转录纯化试剂盒ThermoFisher ScientificAM1908保存于 4 °C
RNA酶降解表面活性剂：RnaseZAPSigma-AldrichR2020保存于室温（RT）
大肠杆菌 O111:B4 超纯 LPSInvivogen保存于 -20 °C
野生型 IKKβ 质粒Addgene11103保存于 -20 °C
野生型 NEMO 质粒Addgene27268保存于 -20 °C

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标签

mRNA mRNA

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