使用修饰mRNA转染原代巨噬细胞

摘要

来源：Herb, M. 等，利用体外转录mRNA高效转染原代巨噬细胞。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用编码绿色荧光蛋白的修饰mRNA转染原代巨噬细胞的过程。这些经过修饰的mRNA旨在降低免疫原性并提高其稳定性，从而确保成功转染及后续绿色荧光蛋白的表达，转染效果通过荧光显微镜观察确认。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意： 所有操作步骤均需佩戴手套。所有转染步骤均须在层流罩内进行，以防止细胞污染。在使用 mRNA 前，须用 70% 乙醇和/或可降解 RNA 酶的表面活性剂清洁所有仪器（如移液器）及工作台面（材料表）。确保所有反应管无 RNA 酶且无菌。稀释时仅使用无菌、无 RNA 酶的水。移液枪头必须使用带滤芯的类型，并且每次移液后均需更换新枪头。

1. DNA模板的制备

注意： 用于 体外 使用本方案进行 mRNA 转录时，必须包含 T7 启动子序列，以允许 RNA 聚合酶结合。若含有目的蛋白 DNA 序列的质粒已在目的序列正上游包含正确方向的 T7 启动子序列，则需对质粒进行线性化处理（见步骤 1.1）。否则，需通过聚合酶链式反应（PCR，见步骤 1.2）将 T7 启动子连接至目的序列。

1. 含有T7启动子的质粒线性化
   1. 使用限制性内切酶对已含有正确方向T7启动子序列的质粒进行酶切，酶切位点应位于目的序列终止密码子的下游，以实现质粒的线....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-甲基-CTP（100 mM）	Jena Biosience	NU-1138S	保存于 -20 °C
南极磷酸酶	New England BioLabs	M0289	保存于 -20 °C
南极磷酸酶反应缓冲液（10X）	New England BioLabs	B0289	保存于 -20 °C
抗-NEMO/IKKγ 抗体	Invitrogen	MA1-41046	保存于 -20 °C
抗-β-肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A2228	保存于 -20 °C
带卡槽的 92.16 mm 培养皿	Sarstedt	8,21,473	保存于室温（RT）
CD11b 微珠（小鼠和人用）	Miltenyi Biotec	130-049-601	保存于 4 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3′，保存于 -20 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′，保存于 -20 °C
DNA 纯化试剂盒：QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	保存于室温（RT）
eGFP + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3′，保存于 -20 °C
eGFP + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5′-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3′，保存于 -20 °C
快速消化缓冲液（10X）	Thermo Scientific	B64	保存于 -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	保存于 -20 °C
高保真聚合酶（带校对功能）：Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs Inc	M0491S	保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′，保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′，保存于 -20 °C
in vitro mRNA 转录试剂盒：HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含 polyA 加尾）	New England BioLabs	E2060	保存于 -20 °C
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	保存于室温（RT）
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303	保存于室温（RT）
mRNA 转染缓冲液及试剂：jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	保存于 4 °C
突变型 IKKβ IKK-2S177/181E 质粒	Addgene	11105	保存于 -20 °C
突变型 NEMO C54/347A 质粒	Addgene	27268	保存于 -20 °C
pEGFP-N3 质粒	Addgene	62043	保存于 -20 °C
Poly(I:C)	Calbiochem	528906	保存于 -20 °C
pPGK-Cre 质粒			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, 新型可诱导 Cre 重组酶：一种新型 Cre-PR 融合蛋白突变体表现出更高的敏感性和更广的可诱导范围。Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001)。保存于 -20 °C
假尿苷三磷酸（Pseudo-UTP，100 mM）	Jena Biosience	NU-1139S	保存于 -20 °C
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	保存于室温（RT）
大鼠抗小鼠 CD11b 抗体，APC 标记	BioLegend	101212	保存于 4 °C
大鼠抗小鼠 F4/80 抗体，PE 标记	eBioscience	12-4801-82	保存于 4 °C
重组 M-CSF	Peprotech	315-02	保存于 -20 °C
RNA 纯化试剂盒：MEGAclear 转录纯化试剂盒	ThermoFisher Scientific	AM1908	保存于 4 °C
RNA酶降解表面活性剂：RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	保存于室温（RT）
大肠杆菌 O111:B4 超纯 LPS	Invivogen		保存于 -20 °C
野生型 IKKβ 质粒	Addgene	11103	保存于 -20 °C
野生型 NEMO 质粒	Addgene	27268	保存于 -20 °C