近红外光免疫疗法用于混合三维培养物中的靶向细胞清除

摘要

来源：Sato, K. 等，利用近红外光免疫疗法从混合三维培养物中选择性清除细胞。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用近红外光免疫疗法选择性清除混合三维细胞培养物中特定细胞的技术。该方法通过与近红外光吸收剂偶联的抗体精确识别靶向细胞，随后经红外光照射诱导靶向细胞死亡，从而有效从三维培养物中清除这些靶向细胞。

方案

注意：以下方案描述了使用近红外光免疫治疗（NIR-PIT）消除特定细胞所需的步骤。有关对照组及其他关于NIR-PIT和细胞活力的详细信息，可参见其他文献。

1. 红外染料700（IR700）与单克隆抗体（mAb）的偶联

1. 将目标单克隆抗体（mAb）以 2–5 mg/ml 的浓度溶于 0.1 M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）溶液（pH 8.6）中。
2. 在微量离心管中，将 6.8 nmol 的 mAb 与 30.8 nmol 的 10 mM IR700 溶于 0.1 M Na₂HPO₄ 溶液（pH 8.6）中混合，并用铝箔包裹后在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15 ml PBS 对 PD-10 柱（参见材料/设备表）清洗两次。然后加载第 1.2 步的样品。
4. 根据制造商说明书，通过 PBS 洗脱 PD-10 柱以纯化混合物。
   注意：此处洗脱应沿 IR700 的显色条带进行。对于 300 µl 的样品，PBS 洗脱组分通常在 2.5 ml 至 4.4 ml 之间。
5. 通过分光光度计在 595 nm 处测定考马斯亮蓝染色的吸光度，确定蛋白浓度；在 689 nm 处测定 IR700 的吸光度，以确认每个 mAb 分子上偶联的荧光染料分子数量。
   注意：使用分光光度计确定每个 mAb 分子上 IR700 分子的最佳偶联数量至关重要。通常，每个 mAb 分子偶联约 3 个 IR700 分子，适用于体外（in vitro）和体内（in vivo）实验。可采用高效液相色谱法（HPLC）和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）确认 mAb 与 IR700 是否成功结合。
6. 测定蛋白浓度后，于 4 °C 保存。

2. 混合三维细胞培养（混合类球体）的制备

1. 向悬滴板的板槽部分加入无菌水（约1 ml）。
2. 制备不同比例的目标细胞类型——A431-荧光素酶-绿色荧光蛋白（A431-luc-GFP）细胞和3T3-红色荧光蛋白（3T3-RFP）细胞——每个样本总细胞数为5,000个，悬浮于50 µl培养基中。
   注意：配制 1:100、10:100、25:100、50:100 等等。 根据细胞类型，培养基中目标细胞类型的比率。
3. 在37 °C、5%二氧化碳的湿化培养箱中，将混合物于96孔悬滴培养板中孵育5-7天。每2天更换一次培养基。 注意操作培养板时需轻柔，以确保3D球状体的精确形成，因为含细胞的液滴在形成3D结构前容易脱落。
4. 使用倒置明场显微镜在10X - 40X放大倍数下观察类球体的形态和大小。 注意：尽管结果可能因细胞类型和悬滴大小而异，但在96孔悬滴板中培养7天后，应确保球状体的直径约为400–600 µm。

3. 体外 用于混合三维细胞共培养的近红外光免疫治疗

1. 将悬滴培养板中的培养基更换为含 10 µg/ml 抗体-光吸收剂偶联物（APC）的培养基，在 37 °C、5% 二氧化碳的湿化培养箱中孵育 6 小时。
2. 孵育 6 小时后，用新鲜的培养基（不含酚红）清洗类球体两次。使用剪去尖端的无菌 200 µl 吸头，将类球体轻柔转移至含 100 µl 新鲜不含酚红培养基的玻璃底 50 mm 培养皿中。每个培养皿中放置一个类球体。
3. 使用倒置明场显微镜观察类球体，检测其形态变化。若需观察光学报告分子（例如，GFP 和 RFP），使用荧光显微镜并设置以下滤光片：GFP — 激发滤光片 469 nm，发射滤光片 525 nm；RFP — 激发滤光片 559 nm，发射滤光片 630 nm。
4. 将发光二极管（LED）置于玻璃底培养皿上方进行照射。
   注意：类球体可在显微镜下或超净台内接受近红外光（NIR）照射。
   1. 使用光功率计测量近红外光的功率密度。根据该测量结果，通过发射波长为 670 至 710 nm 的发光二极管（LED）照射近红外光，剂量为 2 J/cm²。
      注意：LED 光可穿透的最大深度约为 5 英寸。近红外光免疫靶向治疗（NIR-PIT）的细胞毒性效应仅取决于给予的能量，与功率密度和照射时间无关。
5. 照射后，将类球体转移至新的悬滴培养板中，加入 50 µl 新鲜培养基，并在 37 °C、5% 二氧化碳的湿化培养箱中继续孵育 1 天。
6. 使用剪去尖端的无菌 200 µl 吸头，将类球体轻柔转移至含 100 µl 新鲜培养基（不含酚红）的玻璃底培养皿中。在近红外光免疫靶向治疗（NIR-PIT）后 1 天，使用第 3.3 步所述的滤光片设置，通过荧光显微镜观察类球体。
   1. 通过向培养基中加入碘化丙啶至终浓度为 2 µg/ml，或通过荧光显微镜检测胞质 GFP 荧光的丢失情况，来检测死亡细胞（图 1B）。
7. 若靶细胞未被完全清除，则重复步骤 3.1–3.6。

结果

图1. 三维细胞球体中靶细胞的清除（A431-luc-GFP 与 3T3-RFP 细胞的混合球体）。 （A）显示近红外光免疫治疗（NIR-PIT，2 J/cm²）方案。（B）在混合三维细胞球体中，重复的近红外光免疫治疗完全清除了靶细胞（A431-luc-GFP），而对非靶细胞（3T3-RFP）无损伤。标尺 = 200 µm。（C）荧光素酶活性（RLU 比值）的定量分析表明靶细胞被完全清除（每组 n = 10 个球体）。数据以均值 ± 标准误表示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IRDye 700DX 酯类近红外染料	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 柱（PD-10）	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie（Bradford）Plus 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96 孔悬滴培养板	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
光功率计	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED：L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix（帕尼单抗）	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm 玻底培养皿，培养皿直径 35 mm，孔径 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N