分离脐带血造血干细胞以制备人免疫系统小鼠

摘要

来源：Lanis, J. M.，等。在携带人类肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种构建人免疫系统（HIS）小鼠模型的技术。从人脐带血富集层细胞中，使用抗体包被的磁珠分离出 CD34⁺ 造血干细胞（HSCs）。CD34⁺ HSCs 在富含细胞因子的生长培养基中进行扩增，并进行冷冻保存。最后，将解冻后的 HSCs 注射到免疫缺陷小鼠幼鼠体内，以建立 HIS 小鼠模型。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。所有涉及动物模型的程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 人源化免疫系统小鼠的制备

1. BALB/c小鼠的饲养管理Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) 小鼠
   注意： 该品系免疫缺陷极为严重，缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞。因此，必须采取严格措施以防止机会性感染。将动物群维持在含有甲氧苄啶和磺胺嘧啶的饲料上，与正常饲料每两周交替一次。饲养于最高级别的防护屏障环境中（例如，设有淋浴间进入的屏障设施，且限制人员进出）。
   1. 维持 BALB/c 品系小鼠群体Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) 和 BALB/c Rag2^null Il2RγC^null Sirpa^Balb/c 使用 (BRG) 纯合小鼠作为繁殖种鼠。
   2. Breed BRGS^N/N×BRG^B/B 以生成BRGS^B/N 幼鼠，用于接受人源干细胞移植。在此品系中，BRGS^B/N 比BRGS更健康^N/N，且在相当水平上植入（高于BRG）。
2. 从脐带血（CB）中分离CD34+人源干细胞
   注意： 此操作过程中不使用抗生素，因此必须严格遵守无菌操作技术。
   1. 在已灭菌的生物安全柜（BSC）中放置一个50 mL离心管架，以及3个15 mL和约10个50 mL离心管。用70%乙醇喷洒采血袋，并在生物安全柜中晾干。
   2. 计算用于脐带血密度梯度分离的50 mL离心管数量 = 脐带血体积 / 15，向上取整并调整为偶数个管。计算每管血液体积 = 脐带血体积 / 管数。将血液从脐带血袋中小心倒入各离心管中，每管最多不超过15 mL。使用自动移液器和25 mL血清移液管，以1:1比例将血液与无菌PBS上下吹打混匀。
   3. 使用自动移液器以低速配合10 mL血清学移液管，将室温（RT）1.077 g/mL密度梯度溶液缓慢铺于血液下方（参见 材料列表）时不要扰动界面，移液枪枪头避免接触管底。对所有管重复此操作。然后以850 x g离心30分钟 g，不进行制动，于室温下离心，以确保密度梯度的维持。
   4. 在1.077 g/mL密度梯度液上方观察到呈乳白色云雾状的细胞层（即血沉棕黄层）。使用25 mL血清移液管和自动移液器，将血浆层移除并弃去，保留约10 mL液层在血沉棕黄层上方。
   5. 用无菌移液管或血清移液管收集白膜层。将移液管当作刮铲使用，在缓慢释放吸球（或缓慢吸取）的同时，将细胞从锥形管管壁上刮下并吸入管中。将两个50 mL锥形管中的白膜层合并至一个全新的50 mL锥形管中。
   6. 通过向每个锥形管中加入 45 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）的无菌 Hanks' 平衡盐溶液（HBSS），洗涤细胞。在 360 x g 条件下离心 11 分钟 g 室温下
   7. 吸弃所有离心管中的洗涤液，保留沉淀。使用10 mL血清移液管和自动移液器，将第一个沉淀重悬于含2% FBS的10 mL HBSS中。将每个沉淀均重悬于相同的10 mL HBSS中，并用额外的10 mL HBSS冲洗每根离心管，以收集全部细胞至同一根离心管中。
   8. 加入45 mL含2% FBS的无菌HBSS至锥形管中。360 x g离心10 min g，4 °C下。
   9. 吸弃洗涤缓冲液，直至接近细胞沉淀，然后将沉淀重悬于 20 mL 磁性细胞分选缓冲液中（参见 材料表）。取出少量等分试样，用亚甲蓝按1:20稀释后，用血细胞计数板计数细胞。统计蓝色和白色细胞的数量。在360 × g离心 g，4 °C 下 10 分钟。
      注意： 本方案采用磁珠技术（参见 材料表该方案可进行调整，以适用于任何细胞分离技术，从而获得足够纯度和得率的CD34+干细胞。
   10. 吸弃上清液，将从脐带血中分离得到的CD34+细胞沉淀重悬于每1×10⁶个细胞300 µL磁性细胞分选缓冲液中⁸ 细胞。先加入100 µL Fc受体（FcR）阻断试剂，然后每1 × 10⁷个细胞加入100 µL CD34+磁珠。⁸ 细胞。在4 °C下孵育30分钟（不使用冰）。
   11. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 mL 磁性细胞分选缓冲液⁸ 细胞并以 360 x g 4 °C 下离心 10 分钟。重复洗涤步骤，然后将沉淀重悬于每 1 × 10⁷ 个细胞 500 µL 磁性细胞分选缓冲液中⁸ 15 mL 圆底离心管中，标记为“未分级细胞”。
   12. 标记另外两个15 mL离心管，分别标注为“CD34-”和“CD34+”。将三个15 mL离心管（未分选、CD34- 和 CD34+）分别放入冷却架上的A1、B1和C1位点（参见 材料表）。使用自动磁性细胞分选仪上的双柱阳性选择程序分离细胞（参见 材料表按照制造商的仪器说明书，在生物安全柜（BSC）中进行。
3. 扩增与冻存CD34+人类干细胞
   1. 将回收的 CD34+ 细胞悬液（2 mL）取 10 µL 加样至血细胞计数板，于 10 倍镜下计数细胞。通过将细胞计数结果乘以 2 × 10 计算 CD34+ 细胞总数。⁴将总的 CD34+ 细胞数除以 250,000，以计算需要冻存的冻存管数量（每只小鼠幼崽移植前需 50,000 个细胞） 体外 扩增）
   2. 制备含10%胎牛血清（FCS）的Iscove培养基（额外多加1 mL以补偿过滤损失），并添加40 ng/mL干细胞因子、20 ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）和10 ng/mL白细胞介素-6（IL-6），经0.22 µm滤器过滤。将CD34+细胞重悬于上述培养基中，浓度为100,000个细胞/mL，于37 °C孵育。第3天时，向含细胞及含细胞因子培养基的培养瓶中加入等体积的不含细胞因子的CB培养基。
      注意： 在CB培养基中添加这些细胞因子可促进CD34+细胞的存活与扩增，同时抑制其分化。
   3. 第5天收获扩增的CD34+细胞。用移液器将细胞悬液吹打混匀，收集至50 mL锥形管中。加入足量的脐血培养基覆盖培养瓶底部。使用细胞刮刀彻底刮取培养瓶整个底部。将所有培养基收集至同一50 mL管中，于360 x g离心 g 11 分钟
   4. 将细胞重悬于 2 mL CB 培养基中。将移液管中的最后一滴液体保留并加入 96 孔板中用于计数。用台盼蓝以 1:1 比例稀释细胞，取 10 µL 加入血细胞计数板，计数四个象限的细胞并取平均值。将细胞计数结果乘以 4 x 10，计算 CD34+ 细胞的总数。⁴，记录细胞活力。
   5. 配制 n+1 mL 冻存液，其中 n 为步骤 1.3.1 中计算出的冻存管数量。通过将 10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）加入胎牛血清（FBS）中制备冻存液，并置于冰上保存。在冻存管上标记 CB#、CD34+ d5 及日期。
   6. 以 360 x g 离心 CD34+ 细胞 g 4 °C 下孵育 10 分钟。吸除上清液至沉淀处，将细胞沉淀重悬于冻存液中。每管分装 1 mL 细胞悬液，剩余部分平均分配至各管。将冻存管加入预冷至 4 °C 的异丙醇细胞冻存盒中，置于 -80 °C 保存，随后转移至液氮中长期储存。 >90 天
4. 小鼠幼崽的照射
   1. 收集 BRGS^B/N 将出生后1至3天的幼鼠放入已灭菌的塑料盒中，并铺有垫料。加入少量带有幼鼠的垫料。用笼号和幼鼠数量标记盒子。
   2. 设置照射器（参见 材料表) 以300 rad剂量照射。将幼鼠盒放入照射仪中，进行300 rad照射。照射后将幼鼠放回笼中，堆叠在一起，并覆盖垫料。
5. 幼鼠注射与CD34+细胞制备
   1. 照射后约3小时开始CD34+细胞准备。在50 mL锥形管中预热10 mL脐血培养基。所有操作均在无菌生物安全柜中进行。
   2. 取出一个冻存管 体外 每四到六只幼鼠注射扩增并冻存的CD34+细胞。在55 °C快速解冻，直至仅剩少量冰晶可见，立即将细胞加入预热的CB培养基中（管壁触感仍应微凉）。用1 mL培养基冲洗每支冻存管，并以360 x g离心细胞 g 4 °C下离心12分钟。
      ​注意： 在55 °C下快速解冻的细胞存活率（90%-95%）优于37 °C解冻。
   3. 小心吸除培养基。将（少量）沉淀物重悬于2 mL CB培养基中，轻轻混匀，取约30 µL细胞悬液加入计数板的一个孔中。用台盼蓝1:1稀释后，取10 µL加入血细胞计数板，计数四个象限的细胞并计算平均值。
   4. 通过将细胞计数乘以 4 x 10 计算 CD34+ 细胞的总数⁴ 然后记录存活率。以360 x g 4 °C下离心12分钟。
   5. 小心吸除培养基，将细胞沉淀重悬于每 n+1 只待注射仔鼠加入 100 µL 无菌 PBS，使每只小鼠获得 250,000–450,000 个 CD34+ 细胞。将锥形管置于运输容器中的冰上，运送至动物房进行仔鼠注射。
   6. 将加热灯、尿布、1 mL注射器、18 G针头、30 G针头以及置于无菌容器中的CD34+细胞制备液带至动物房生物安全柜（BSC）中。在加热灯下方约0.6米处放置一张无菌尿布。取出待注射幼崽所在的笼子，并将其放入生物安全柜内。
   7. 将18 G斜面针头安装到注射器上。将锥形管的角度与针头斜面匹配，轻柔混匀并吸取细胞悬液。将幼鼠置于尿布上保温（注意防止过热）。排出注射器中的空气，取下18 G针头，换上30 G针头，然后小心推动注射器，使细胞悬液刚好到达针尖处。
      注意： 或者，也可使用胰岛素注射器。
   8. 一次取一只幼鼠，将其移至远离热源的尿布边缘。用拇指和食指从侧面固定幼鼠，使其面部清晰可见。注意观察耳部下方脸颊处的静脉。将针头浅刺入靠近眼睛的静脉（IV），缓慢注射50 µL细胞悬液。
   9. 检查皮下注射时是否有气泡形成。如有，将针头插入更深后继续注射细胞。成功时可见少量血液或血肿。
   10. 将幼鼠保持固定后，用另外50 µL细胞悬液对同一幼鼠进行肝内注射（IH），使每只幼鼠的静脉注射加肝内注射总量达到100 µL。肝脏可观察为位于白色乳糜带与胸廓之间的深色斑点。将已注射的幼鼠放置在远离未注射幼鼠且远离热源的尿垫上。
       注意： 静脉注射（IV）比单独使用颅内注射（IH）能获得更好的长期嵌合率，但静脉注射并非总能成功。因此，将注射途径分为静脉注射和颅内注射两部分，可确保在更大比例的小鼠中实现成功植入。
   11. 对所有幼鼠重复进行面静脉和颅内注射。清除任何血液，将幼鼠放回笼中巢穴，并用垫料覆盖。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带针头的 1 mL 注射器	McKesson	1031815
15 mL 离心管	Grenier Bio-One	188271
2-巯基乙醇	Sigma	M6250
50 mL 离心管	Grenier Bio-One	227261
AutoMACS Pro 分选仪	Miltenyi	130-092-545
BSA	Fisher Scientific	BP1600100
Chill 15 冷却架	Miltenyi	130-092-952
胚胎干细胞 FCS	Gibco	10439001
Eppendorf 管；1.5 mL 容量	Grenier Bio-One	616201
Excel	Microsoft
FBS	Benchmark	100-106 500mL
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	45001752
玻璃移液管	DKW Life Sciences	63A53
含 Ca & Mg 的 HBSS	Sigma	55037C
MultiRad 350	Precision X-Ray
PBS	Corning	45000-446
PRISM	Graphpad
重组人 FLT3L	R&D systems	308-FK-005/CF
重组人 IL6	R&D systems	206-IL-010/CF
重组人 SCF	R&D systems	255SC010
25 mL 血清移液管	Fisher Scientific	1367811
无菌滤器	Nalgene	567-0020
无菌分子用水	Sigma	7732-18-5
Yeti 细胞分析仪	Bio-Rad	12004279