小鼠皮下不完全切除肿瘤模型中的辅助治疗方案

摘要

来源：Rwandamuriye, F. X. 等，用于测试（新）辅助治疗的不完全切除软组织肉瘤小鼠模型。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在皮下肿瘤未完全切除的小鼠模型中，测试辅助治疗或附加疗法的效果。对部分肿瘤切除的小鼠给予靶向调节性T细胞抗细胞毒性蛋白的抗体治疗，可能减少肿瘤再生长，提示该疗法具有有效的辅助治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 细胞接种

1. 细胞与动物的准备
   1. 确保细胞系在推荐的培养基中维持培养。例如，将 WEHI 164 细胞系维持在 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基中，该培养基需添加 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清、20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)、0.05 mM 2-巯基乙醇、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。
      注意：细胞从低温保存中复苏后，至少传代 3 次，最多可传代 5 次。为确保最佳细胞活力，应在细胞融合度达到 70–80% 时进行传代。肿瘤细胞系应检测支原体污染，因为感染可能改变细胞生长特性并影响体内的免疫反应。
   2. 接种前一天，使用电动剃毛器剃除小鼠右下腹部的毛发。
      注意：本实验使用 8–12 周龄、体重正常（16–22 克）的雌性 BALB/c 小鼠。
   3. 接种当天，当 WEHI 164 细胞融合度达到 70–80% 时，通过胰酶消化收获细胞。
      1. 吸除组织培养瓶中的培养基，然后加入无菌磷酸盐缓冲液 (1× PBS)，以去除残留的胎牛血清 (FBS)。
      2. 吸除 PBS，向培养瓶中加入 3 mL 0.05% 胰酶（适用于 T75 培养瓶），轻轻旋转培养瓶，使胰酶覆盖整个细胞表面。
      3. 将培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 3 分钟。定期检查细胞，轻敲培养瓶壁以观察细胞是否已脱落。
      4. 从细胞培养箱中取出培养瓶，加入 5 mL 含 FBS 的培养基以中和胰酶。
         注意：避免细胞在胰酶中停留过长时间，以免损伤细胞并导致细胞活力降低。
      5. 反复吹打细胞悬液，获得单细胞悬液，并将其转移至锥形离心管中。
      6. 在 350 × g 条件下离心 3 分钟，收集细胞沉淀。
   4. 用 1× PBS 洗涤细胞三次。
      1. 将细胞重悬于 50 mL 无菌 1× PBS 中，通过上下吹打混匀洗涤细胞，然后在 350 × g 条件下离心 3 分钟收集细胞沉淀。
      2. 吸除上清液，将细胞重悬于 15 mL 无菌 1× PBS 中，通过吹打混匀洗涤细胞，然后在 350 × g 条件下离心 3 分钟收集细胞沉淀。
      3. 吸除上清液，将细胞精确重悬于 10 mL 无菌 1× PBS 中，按步骤 1.1.4.2 的方法洗涤细胞，并取少量（约 100 µL）细胞悬液转移至离心管中用于细胞计数。在 350 × g 条件下离心 3 分钟收集细胞沉淀。
   5. 采用台盼蓝排斥法，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。将细胞重悬于无菌 1× PBS 中，调整浓度至 5 × 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液置于冰上保存。
      注意：肿瘤细胞的活力应等于或高于 80%，以确保肿瘤生长的可重复性。
2. 皮下接种
   1. 充分混匀细胞悬液，用 26 G 针头的注射器吸取 100 µL 细胞悬液（含 5 × 10⁵ 个细胞）溶于无菌 1× PBS 中。每次装填新注射器前均需重新混匀细胞悬液。
      注意：整个操作过程中应将细胞置于冰上，以维持其活力。
   2. 适当固定小鼠，确保可接触其右下腹部区域。在剃毛的右下腹部皮下接种细胞悬液。
      注意：接种时应略微抬起针头，确保针头位于皮下而非腹腔内，此时可在皮肤下观察到针头。接种后皮肤下应形成类似气泡的隆起。
   3. 根据相关伦理审批要求监测小鼠状态，当肿瘤生长至约 50 mm² 时进行手术切除。

2. 肿瘤的部分手术切除

注意：本方案需要两名研究人员；一名负责手术操作（手术者），另一名负责小鼠监测（助手）。

1. 手术准备
   1. 接种后第12天，当肿瘤大小达到约50 mm²时，在手术前30分钟，于颈部背侧皮肤下（s.c.）给予小鼠100 µL（0.1 mg/kg）的丁丙诺啡。
   2. 设置手术区域：在手术台上铺上覆盖 bench coat 的加热垫，并设置麻醉用鼻罩。使用热珠灭菌器在使用前及每只动物之间对手术器械进行灭菌，并在使用前让器械冷却。准备好以下清洁且易于取用的手术器械：氯己定、棉签、纱布、眼用凝胶、两把弯头镊子、剪刀、施夹器、取夹器和备用夹子（图1A, 1B）。
   3. 将加热恢复舱预热至37 °C，并另设一个加热垫用于术后恢复（图1C）。将已灭菌的器械放置在无菌表面（如高压灭菌垫）上。
2. 麻醉
   1. 将小鼠放入诱导舱中，使用4%异氟烷（4%浓度，100%氧气，流速1 L/min）进行麻醉，直至呼吸频率降至约每分钟60次（每秒1次）（通常需要<1分钟）。
      注意：不要让小鼠在诱导舱内停留过久，以免导致窒息甚至死亡。每次仅允许一只小鼠接受麻醉。
   2. 将小鼠转移至手术台上的加热垫上，将其鼻部置于鼻罩中，并以3–4%异氟烷（100%氧气，流速0.5 L/min）维持麻醉状态。持续监测呼吸频率，以确保麻醉深度适当。
      注意：助手必须在整个手术过程中持续监测小鼠的呼吸，以确保维持适当的麻醉水平。若呼吸过慢，则降低麻醉剂浓度；若麻醉过浅，则提高浓度。若小鼠出现喘息，应立即将其移出鼻罩，降低麻醉浓度，并等待呼吸恢复正常后再重新放入鼻罩。
   3. 在开始手术前，执行“夹趾测试”和“角膜反射测试”，以确认小鼠已完全麻醉。
      注意：小鼠任何部位的活动均表明其未完全麻醉，应立即通过提高麻醉浓度追加麻醉剂。
   4. 用少量眼用凝胶覆盖小鼠眼睛，防止角膜干燥。
3. 手术操作
   1. 用含酒精的氯己定对术区进行三次擦拭。使用镊子和剪刀，在肿瘤旁3 mm处沿背部做一条长约1 cm的直线切口（图2A, 2B）。
      注意：使用尺子将每只小鼠的切口标准化为1 cm，有助于在不同小鼠间公平评估伤口愈合情况。将切口位置设在距肿瘤3 mm处，可为后续的瘤内辅助治疗提供便利，避免治疗剂从伤口泄漏。
   2. 使用镊子分离肿瘤与腹膜之间的筋膜及皮下脂肪组织。皮下肿瘤通常与皮肤侧相连。
   3. 用镊子轻轻夹住带瘤侧的皮肤，打开切口并“外翻”肿瘤，使其暴露于体外（图2C, 2D）。
      注意：待切除的肿瘤部分应尽量靠近切口，以确保有足够的皮肤覆盖伤口。切除肿瘤时需小心，避免损伤皮肤。
   4. 使用剪刀从靠近切口的肿瘤基底部开始，将肿瘤包膜剪开一半以移除肿瘤。
   5. 对于50%减瘤手术，沿肿瘤中线横向切除。使用弯头镊子挖出需移除的肿瘤部分（50%），并清除减瘤区域内的残留组织。
   6. 对于75%减瘤手术，先按上述第2.3.5步完成50%的肿瘤切除，然后将剩余的50%肿瘤再切开一半，使用弯头镊子挖出其中25%的肿瘤组织，操作方法同上。
4. 关闭手术切口
   1. 将剩余的肿瘤组织复位至皮肤下方，使用镊子将两侧皮瓣拉拢并对齐切口边缘。
   2. 在距切口边缘约5 mm处固定皮肤，使用外科夹闭合切口，从靠近镊子的一侧开始。根据需要使用足够数量的夹子，确保无皮下组织外露。通常使用三到四个夹子，夹子之间间隔约2 mm。
      注意：若发现夹子未正确闭合，应使用取夹器移除并更换新的夹子。
5. 小鼠术后恢复
   1. 将小鼠放入预热至37 °C的加热恢复舱中，使其苏醒。
   2. 将小鼠笼子置于加热垫上。在加热舱中持续监测小鼠，直至其从麻醉中恢复（清醒并能行走），然后将其放回笼中。继续将笼子置于加热垫上10分钟，直至小鼠活动明显增加。
   3. 为小鼠提供湿润软食。术后1小时观察小鼠恢复情况，并确认夹子位置稳固。将笼子一半置于加热垫上、一半置于外侧，以便无人看护时小鼠可自行调节体温。
   4. 术后6–8小时（当天结束前），在颈部背侧皮下注射0.1 mg/kg丁丙诺啡（100 µL）。次日清晨再次监测小鼠，并重复给予0.1 mg/kg丁丙诺啡（100 µL，皮下注射）。根据需要补充湿润食物。
   5. 术后连续七天每日监测小鼠。术后第七天可使用取夹器移除夹子。
6. 辅助或新辅助治疗
   1. 根据研究所需的治疗方案，在围手术期对小鼠实施（新）辅助治疗。
   2. 例如，在接种后第15天，腹腔注射（i.p.）单次100 µg抗CTLA-4抗体；或在接种后第15、17和19天，分三次每次腹腔注射200 µg抗PD-1抗体。

结果

图1：手术设置的代表性图像。（A）手术设置的全景图，显示手术器械（见步骤2.1所列）和麻醉机。（B）手术台的局部图像，展示所有触手可及的材料。（C）用于小鼠恢复的加热舱和加热垫。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26 号 0.5 mL 胰岛素注射器	Becton Dickinson, Australia	326769	无
2-巯基乙醇	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	无
麻醉气体机	Darvall Vet, Australia	SKU: 2848	无
抗 CTLA-4 抗体	BioXcell, USA	BE0164	无
抗 PD-1 抗体	BioXcell, USA	BP0273	无
盐酸丁丙诺啡注射液，0.3 mg/mL	RB healthcare UK Limited, UK	55175	处方订购
氯己定外科洗手液 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(scrub	无
胎牛血清	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	无
精细镊子 10.5 cm	Surgical house, Western Australia	CC74110	无
精细带齿镊子 12 cm	Surgical house, Western Australia	CC74212	无
Halsted 镊子 14 cm	Surgical house, Western Australia	CD01114	无
加热舱	Datesand Ltd, UK	Mini-Thermacage	无
HEPES (1 M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	无
异氟烷	Henry Schein Animal Health, Australia	SKU: 29405	处方订购
润滑眼膏	Alcon	n/a	无
青霉素/链霉素 1000 倍	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	无
磷酸盐缓冲液 10 倍	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	无
Reflex 7 mm 夹子	Able scientific, Australia	AS59038	无
Reflex 7 mm 伤口夹施夹器	Able scientific, Australia	AS59036	无
Reflex 伤口夹移除器	Able scientific, Australia	AS59037	无
啮齿类动物 Qube 麻醉呼吸回路	Darvall Vet, Australia	#7885	无
RPMI 1640 培养基 + L-谷氨酰胺（Roswell Park Memorial Institute）	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	无
虹膜剪 STR 11 cm	Surgical house, Western Australia	KF3211	无
虹膜剪 STR 9 cm	Surgical house, Western Australia	JH4209	无
小型诱导舱	Darvall Vet, Australia	SKU: 9630	无
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	无