一种在小鼠模型中进行人类皮肤移植的技术

摘要

来源：Moss, M. I. 等，用于调控人源免疫反应的异种移植皮肤模型体内研究。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种将人类皮肤移植到中性粒细胞反应受抑制的免疫缺陷小鼠上的方法。该方法包括将人类薄层皮肤移植物贴附于小鼠的移植床，进行封闭并覆盖保护以促进恢复。最终，人类皮肤与小鼠皮肤牢固结合，建立血管化和血液循环，从而实现成功的异种皮肤移植。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 供体人皮肤样本的处理

注意：本移植实验所使用的人类皮肤样本为从一名健康受试者腹部获取的大块组织。样本尺寸必须至少为 15 cm × 7.5 cm。样本尺寸的限制可能会影响可用于移植的小鼠数量以及移植物大小的选择。

1. 在制备和移植前，将皮肤样本保持在低温环境（置于冰上或4°C）中。将样本保存在封闭的标本采集杯中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）浸湿的纱布保持湿润。
   注意：不建议将皮肤样本在4°C下保存超过2天。然而，已有文献报道皮肤样本可保存更长时间。
   注意：所有人体组织均应按照标准生物危害预防措施进行处理。
2. 在无菌负压细胞培养操作台内的无菌解剖板上，准备对人皮肤样本进行皮片切取。
3. 将皮肤样本表皮面向上放置于解剖板上。先用无菌酒精棉片擦拭表皮，再用PBS擦拭。
4. 用一枚1.5英寸的解剖T型针固定皮肤靠近边缘的一侧（参见材料表）。
5. 以400 µm厚度对皮肤样本进行切取，切割时以30°–45°角向前均匀施压。遵循所有仪器特定的操作说明和安全措施（参见材料表）。
   注意：有关皮片切取技术的详细信息，请参阅先前发表的报告。
6. 准备一个100 mm × 20 mm的培养皿，在皿底放置浸有无菌PBS的无菌纱布。将皮肤样本表皮面向上置于湿润的纱布上。
7. 用半透明密封膜（参见材料表）密封并覆盖培养皿边缘，以确保样本不被污染。在移植前将样本储存在4°C环境中。

2. 术前准备与处理

1. 准备无菌器械和无菌手术台用于移植操作。使用经高压灭菌的纸巾作为放置器械和小鼠的无菌表面。
   注意：小鼠可在断奶后进行移植，但优选在8至10周龄之间进行。雄性或雌性小鼠均可用于移植。
2. 在与手术台物理隔离的区域进行手术前准备，例如去除毛发。
3. 将抗GR1抗体（参见材料表）用无菌生理盐水稀释至1 mg/mL。每只小鼠在麻醉诱导后，通过腹腔注射给予100 µg/100 µL的抗GR1溶液。
4. 依次使用异氟烷或其他机构批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。
   注意：诱导期间异氟烷浓度需维持在3%-5%。当小鼠不再活动时，将异氟烷浓度降低至1%-3%，以维持手术期间的麻醉状态。
   1. 通过观察呼吸频率、脚趾夹捏无反应以及耳朵和口腔呈现正常的粉红色，来监测小鼠的麻醉深度。
      警告：应使用适当的麻醉设备和废气清除方法，避免接触异氟烷蒸气。
5. 将小鼠转移至加热垫或其他热源（参见材料表）。
6. 用戴着手套的手指蘸取少量眼用软膏，轻轻涂抹于小鼠眼部。
7. 通过捏起皮肤并以平行于身体的角度注射，皮下给予镇痛药布托啡诺（0.08 mg/kg）和卡洛芬（5 mg/kg）（参见材料表）。
   注意：按照机构规程配制术前镇痛药物。遵循机构关于镇痛药选择和给药的指导原则。本研究中使用的镇痛方法详见步骤2.7和图1。
8. 用尾部轻轻提起小鼠，暴露腹部，使用胰岛素1 mL（12.7 mm）注射器以30°角进行腹腔注射，给予步骤2.4中配制的抗GR1抗体。
9. 使用对动物安全的电动剪毛器（参见材料表）剃除小鼠背部中上部的毛发。
10. 彻底清除所有毛发，并在剃毛区域涂抹足量脱毛膏，作用30秒至1分钟。
11. 用纸巾和PBS彻底擦去脱毛膏。

3. 移植操作步骤

1. 将小鼠转移至次要手术区域，远离脱毛操作区。
2. 使用碘伏棉签以环形方式对手术部位进行消毒，从中心开始向外周脱毛区域边缘擦拭。
3. 在小鼠体表覆盖一块无菌塑料薄膜，并在薄膜上剪出一个略大于待移植区域的窗口。
4. 用手术刀切取一块矩形的供体皮肤（10 mm × 10 mm）用于移植。操作时，用镊子背面牢固固定供体皮肤，沿镊子边缘用手术刀进行切割。
5. 使用手术剪在小鼠皮肤上剪出一个与供体皮肤大小相匹配的矩形区域，形成移植床。用镊子将皮肤轻轻提起，剪刀倾斜远离身体方向进行剪切，以避免深入损伤筋膜层。
6. 将供体皮肤片以表皮面朝上的方向放置于制备好的移植床上。
7. 使用镊子背面轻轻操作皮肤，前后滑动调整位置，直至供体皮肤完全平整贴附于移植床。
8. 在供体皮肤与宿主皮肤交界处滴加数滴外科胶水组织粘合剂（见材料表），并用镊子将小鼠皮肤与供体皮肤压合1–2秒，使胶水与组织充分粘附。完全封闭移植边缘，并等待胶水彻底干燥。
9. 对小鼠进行包扎（图2），步骤如下：
   1. 剪取一块足够大、可完全覆盖移植区域的凡士林纱布（见材料表）。
   2. 用凡士林纱布覆盖移植部位，并用镊子轻轻按压纱布使其贴合皮肤。
   3. 将一片透明薄膜敷料沿长度方向剪成适当宽度，确保其可完全覆盖小鼠伤口。
   4. 将透明薄膜敷料有粘性的一面朝下，牢固按压覆盖在纱布上。迅速滚动小鼠身体，使敷料完全包裹躯干，确保贴合紧密但不影响呼吸，同时所有肢体均可自由活动。
   5. 将小鼠放入恢复笼中并持续观察，直至其清醒并能自主活动。在恢复后至少15分钟内，于笼内一侧提供热源。
      注意：动物通常在放入恢复笼后1–5分钟内恢复。

结果

图1： 异种移植研究中所采用方案的时间线。

图 2：小鼠术后包扎方法。小鼠在麻醉状态下用凡士林纱布和透明薄膜敷料紧密包裹。（A）将凡士林纱布覆盖在略大于手术切口的区域。（B）准备透明薄膜敷料：裁剪一条比凡士林纱布稍宽...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林	Fisher	SF100-20	组织学固定剂
3M Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB	外科胶水
抗 GR1 单克隆抗体 RB6-8C5	BioXcell	BE0075	抗排斥
高压灭菌袋	VWR	89140-800	用于工具和纸巾的高压灭菌
布托啡诺 0.3 mg/mL	Covetrus	59122	镇痛
卡洛芬 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	镇痛
D42 皮肤切片刀片	Humeca	5.D42BL10	皮肤切片机（每样本使用一片刀片）
皮肤切片机 D42	Humeca	4.D42	皮肤切片机
一次性手术刀	Bard-Parker	371610	皮肤准备
解剖 T 型针；1-1/2 英寸，每箱 1000 枚 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	用于将皮肤样本固定于皮肤切片机
解剖剪刀	medicon	02.04.10	样本制备和小鼠解剖
脱氧核糖核酸酶（DNAse）	Sigma-Aldrich	DN25-1G	皮肤消化
电动剪毛器	Kent	CL8787-KIT	脱毛
镊子	medicon	07.60.07	样本制备和小鼠解剖
纱布	Fisherbrand	22-362-178	样本制备
加热灯	Morganville Scientific	HL0100	术后护理
加热垫 4" x 10"	Pristech	20415	手术热源供应
胰岛素注射器 1 cc 12.7 mm	BD	329410	药物给药
异氟烷	美国药典（USP）	NDC 66794-013-25	麻醉
异氟烷麻醉机	VetEquip	911103	麻醉
Nair 男士脱毛膏	Nair	‎10022600588556	脱毛
新霉素、硫酸多粘菌素B和杆菌肽锌眼膏	Dechra	NDC 17478-235-35	眼膏，防止眼睛干燥
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠	The Jackson Laboratory	5557	小鼠
纸巾	Kleenex	100848	可高压灭菌以获得无菌表面
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	13-374-12	半透明密封膜
培养皿 150 mm	Corning	430597	样本储存
塑料保鲜膜	Fisherbrand	22-305-654	操作部位准备
聚维酮碘棉签棒	PDI	S41350	操作部位灭菌
软质饲料与口服补液（Napa Nectar）	Se Lab Group Inc	NC9066511	用于术后恢复不良小鼠的营养补充
标本收集杯	Fisher Scientific	22-150-266	样本储存
无菌酒精擦拭垫	Fisherbrand	22-363-750	皮肤准备
无菌 PBS	Gibco	14190-144	样本储存用培养基
无菌生理盐水	Hospira	NDC 0409-4888-02	用于药物稀释
Tegaderm 敷料膜 4" x 43/4"	3M	1626	透明薄膜伤口敷料
凡士林油纱布 3" x 8"	Kendall	414600	伤口敷料