小鼠模型中的人体皮肤移植技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 供体皮肤样本的处理

注意:本次移植中使用的人体皮肤样本是从健康患者的腹部采集的大样本。样品必须至少为 15 cm x 7.5 cm。大小限制可能会影响可用皮肤的小鼠数量和移植物大小的选择。

1. 在制备和移植之前，将皮肤样品保持在低温（冰上;4°C）。在密闭的标本采集杯中保持样品湿润，将纱布浸泡在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中><。 注意:不建议将皮肤样品在 4 °C 下储存超过 2 天。但是，存在皮肤样本存储时间较长的报告。
   谨慎:使用标准的生物危害预防措施处理所有人体组织。
准备在消毒解剖板上的无菌
2. 负压组织培养罩中对人体皮肤样品进行皮削。
3. 将皮肤样本，表皮面朝上，放在解剖板上。用无菌酒精制备垫擦拭表皮，然后用 PBS 擦拭。
4. 用 1.5 英寸的解剖 T 型针将皮肤的较近边缘固定到位（参见材料表）。
以
5. 400 μm 的厚度对皮肤标本进行皮削，施加稳定的压力，同时以 30°-45° 的角度向前切割。请遵循所有仪器特定的说明和安全措施（参见材料表）。
   注:有关皮节技术的详细信息，请参阅以前发布的报告。
6. 通过在培养皿底部放置浸泡在无菌 PBS 中的无菌纱布，制备一个 100 mm x 20 mm 培养皿。将皮肤，表皮面朝上，放在湿纱布上。
7. 用半透明密封膜密封并覆盖板边缘（参见材料表），以确保样品不受污染。接枝前将样品储存在 4°C。

2. 术前调理和准备

1. 准备无菌器械和无菌手术站以进行移植。使用高压灭菌的纸巾作为放置仪器和鼠标的无菌表面。
   注意:小鼠可以在断奶后移植，但最好在 8-10 周龄之间移植。任何性别的小鼠都可以移植。
2. 在与手术站物理隔离的区域进行手术准备，例如脱毛。
3. 通过在无菌盐水中稀释至 1 mg/mL 来制备抗 GR1（参见材料表）。麻醉诱导后，每只小鼠腹膜内注射 100 μg/100 μL 抗 GR1 溶液。
4. 用异氟醚或其他机构批准的麻醉剂麻醉小鼠，一次一只。
   注意:在诱导过程中需要以 3%-5% 的浓度给予异氟醚。一旦小鼠不动，将异氟醚浓度降低至 1%-3% 以影响手术持续时间。
   1. 通过观察呼吸频率、没有脚趾捏反应以及耳朵和嘴巴的适当粉红色来监测小鼠的适当麻醉深度。
      谨慎:使用适当的麻醉机械和清除方法，并避免接触异氟醚蒸气。
5. 将鼠标转移到加热垫或其他热源（参见材料表）。
6. 用戴手套的手指在眼睛上滴一小滴药膏来涂抹眼药膏。
7. 通过捏住皮肤并以平行于身体的角度注射，皮下施用镇痛药丁丙诺啡 （0.08 mg/kg） 和卡洛芬 （5 mg/kg）（见材料表）。
   注意:按照机构方案准备治疗前镇痛剂。遵循机构指南选择和施用镇痛药。本研究中使用的镇痛方法在步骤 2.7 和图 1 中概述。
8. 通过轻轻抬起小鼠的尾巴，露出腹部，并使用胰岛素 1 mL （12.7 mm） 注射器以 30° 角注射，腹膜内施用抗 GR1（在步骤 2.4 中制备）。
9. 使用对动物安全的电动剪刀（见材料表）剃掉鼠标背侧的中部和上部。
10. 清除所有毛发，将大量脱毛软膏涂抹在剃光的皮肤上 30 秒至 1 分钟。
11. 用纸巾和 PBS 完全擦去脱毛药膏。

3. 移植手术

1. 将鼠标转移到远离脱毛站的辅助手术位置。
2. 用碘拭子棒以圆周运动对手术部位进行消毒，从中间开始，一直向脱毛区域的边缘方向工作。
3. 在鼠标上放一块无菌保鲜膜，并在塑料上切出一个略大于要嫁接区域大小的窗口。
4. 切下 10 毫米 x 10 毫米的矩形供体皮肤部分，用手术刀嫁接。为此，请用镊子的背面牢牢地固定供体皮肤，然后用手术刀沿着镊子切割。
5. 使用手术剪刀，剪下与供体皮肤块大小相匹配的小鼠皮肤的矩形区域，创建一个移植床。用镊子将皮肤从身体上拉开，然后用远离身体的剪刀剪开皮肤，以避免深切到面部。
6. 将供体皮肤片，表皮面朝上，放在准备好的移植床上。
7. 使用镊子的背面，纵皮肤，来回滑动，直到供体皮肤完全平放在移植床上。
8. 在供体皮肤与小鼠皮肤相遇的地方滴入手术胶组织粘合剂（见材料表），并用镊子将小鼠和供体皮肤固定在一起 1-2 秒，使胶水粘附在组织上。完全密封移植物的边缘，让胶水完全干燥。
9. 按照以下步骤为小鼠包扎（图 2）。
   1. 切一块足够大的凡士林纱布（见材料表）以完全覆盖移植区域。
   2. 用凡士林纱布覆盖移植物，并使用镊子将纱布轻轻压在皮肤上。
   3. 纵向剪下一条透明薄膜敷料，使其宽度足够大以覆盖鼠标的伤口。
   4. 用力按压透明薄膜敷料，粘合面朝下，盖在纱布上。快速滚动鼠标，将敷料完全包裹在躯干上，确保其紧密贴合而不妨碍呼吸，并且所有肢体都可以自由活动。
   5. 将鼠标放在恢复笼中并对其进行监控，直到它发出警报并四处移动。恢复后，在笼子的一部分上提供至少 15 分钟的热源。
      注意:预计动物在放入恢复笼后 1-5 分钟内会恢复。

图 1: 异种移植研究采用的方案的时间表。

图 2: 手术后包扎小鼠的方法。在麻醉下，小鼠被紧紧包裹在凡士林纱布和透明薄膜敷料中。（A） 将凡士林纱布放置在比手术伤口略大的区域上。（B） 制备透明薄膜敷料:切出比凡士林纱布略宽的长条。覆盖透明薄膜敷料粘合面的背衬被部分去除。（C） 将薄膜的粘合面牢牢地压在鼠标的背面，在薄膜的前端留出一英寸的空间。（D） 鼠标倒着转动。将胶片的悬垂前部压在鼠标上，并去除背衬。（E） 鼠标被紧紧包裹在薄膜中，剩余的支撑在包裹鼠标时被去除。（F） 鼠标成功包裹在敷料中，其手臂和腿不受约束。