一种构建人PBMC嵌合人源化异种移植小鼠模型的技术

摘要

来源：Li, Z.，等。一种用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型。J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了一种建立人源化异种移植小鼠模型的实验方法。将免疫缺陷小鼠注射环磷酰胺以耗竭其免疫细胞，随后将来源于患者的肿瘤细胞与人外周血单个核细胞（PBMCs）混合于水凝胶中，皮下注射至小鼠体内，从而形成含有T细胞浸润的肿瘤。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。所有涉及动物模型的程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 建立基于人外周血单个核细胞（PBMC）的模型

1. 使用环磷酰胺对NOD/SCID小鼠进行骨髓消融：最佳剂量的确定​
   1. 购买6-8周龄雌性非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠。
      注意： 本研究中使用的所有小鼠均为雌性。
   2. 用生理盐水配制不同剂量的环磷酰胺（CP）（50、100 和 150 mg/kg）。用含 0.8% 吐温-80 的生理盐水配制双硫仑（DS），浓度为 125 mg/kg。
      ​注意： 配制不同浓度的CP，以便向接受不同剂量CP的小鼠注射等体积的药物溶液。
   3. 每天对动物进行一次腹腔注射（i.p.）CP和口服（p.o.）DS，持续2天。每次给予CP后2小时给予DS（p.o.）。
      注意：  DS 可降低环磷酰胺（CP）在小鼠中的泌尿系统毒性，且有研究提示，CP 与 DS 联用相较于单独使用 CP 可导致更持久的中性粒细胞减少。CP 的给药方案可能需要在正式实验前预先确定，且在不同免疫缺陷小鼠品系间存在轻微差异。
   4. 在第0天（首次给药前1小时）和第2天（第二次给药后24小时），从眶静脉窦采集血液样本，并立即置于含乙二胺四乙酸钾（EDTA-K）的抗凝管中，冰上保存。^nd 剂量）以及第4天（第二次给药后72小时）^nd 剂量
   5. 通过荧光激活细胞分选（FACS）检测CP和DS处理后的骨髓消融效应。使用大鼠抗小鼠CD11b（M1/70）、大鼠抗小鼠Ly6C（HK1.4）和大鼠抗小鼠Ly6G（1A8）抗体对CD11b进行设门分析⁺Ly6C^高 如中性粒细胞、CD11b⁺Ly6C^高 单核细胞。
   6. 每天记录小鼠的体重和健康状况，持续一周。环磷酰胺（CP）和地塞米松（DS）的最佳剂量确定为在不引起小鼠严重毒性的情况下，导致中性粒细胞和单核细胞最大程度耗竭的给药方案。
2. 人外周血单个核细胞移植与肿瘤移植：模型建立​
   1. 按照试剂盒说明书，通过密度梯度离心法从健康供者中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。
   2. 按照步骤1.1.2和1.1.3所述，用CP和DS对小鼠进行预处理，以提高移植效率。
   3. 在第二次给予CP和DS剂量后20至24小时，注射人肿瘤细胞系，如A431细胞（ATCC，2.5 × 10⁶) 和 5 × 10⁶ 分离的PBMC（混悬于总体积200 μL含50% Matrigel的磷酸盐缓冲液（PBS）中），或肿瘤组织碎片（3 × 3 × 3 mm）³，总体积为200 μL PBS（含50% Matrigel）中，并加入200 μL的5 × 10⁶ 将PBMCs（每侧100 μL，分别注射至移植瘤组织左右两侧）皮下（s.c.）注射至动物右侧 flank 区域。
   4. 每周测量原发肿瘤体积两次，并记录，持续4-6周。
      注意： 当小鼠体重减轻超过20%或肿瘤体积达到2,000 mm³时，将实施安乐死。³ 或肿瘤已发生溃疡。
   5. 在二氧化碳气体麻醉箱中处死小鼠。使用眼科剪从处死的小鼠中完整取出肿瘤组织，用于组织学和免疫组化（IHC）分析。检测这些组织中人源CD8、PD-1和PD-L1的表达情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBMC 分离 / 细胞培养
Histopaque-1077	Sigma	10771	细胞分离
DMEM	Corning	10-013-CVR	细胞培养
DPBS	Corning	21-031-CVR	细胞培养
FBS	Corning	35-076-CV	细胞培养
青霉素-链霉素溶液（液体）	Gibco	15140-163	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200-114	细胞培养
Matrigel	Corning	356237	CDX 接种
FACS 分析
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	DN25	样本制备
I 型胶原酶	Sigma	C0130	样本制备
抗小鼠/人 CD11b (M1/70) 抗体	BioLegend	101206	FACS
抗小鼠 Ly-6C (HK1.4) 抗体	BioLegend	128008	FACS
抗小鼠 Ly-6G (1A8) 抗体	BioLegend	127614	FACS
抗人 CD8 (OKT8) 抗体	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
抗人 CD279 (MIH4) 抗体	eBioscience	12-9969-42	FACS
抗人 CD3 (HIT3a) 抗体	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT 台式流式细胞仪	Millipore	0500-4008	FACS
肿瘤/PDX 移植 / 给药 / 测量
环磷酰胺	J&K	Cat#419656, CAS#6055-19-2	体内药效
双硫仑	J&K	Cat#591123, CAS#97-77-8	体内药效
注射器	BD	300841	CDX 接种
皮下注射针头（14G）	上海 SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.	0.7*32 TW SB	PDX 接种
游标卡尺（MarCal）	Mahr	16ER	肿瘤测量
IVC 独立通气笼具	Lingyunboji Ltd.	IVC-128	动物设施