来源：Düthorn, A.，等。利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬作用。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频展示了一种基于小干扰RNA（siRNA）的技术，用于干扰自噬流。通过电穿孔法将靶向FIP200 mRNA的siRNA导入单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs），导致FIP200表达下调，从而抑制核纤层蛋白的破坏。 通过 自噬。加入单纯疱疹病毒（HSV）后，由于缺乏核纤层蛋白的破坏，病毒子代的核输出受到抑制 通过 自噬流
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
基于siRNA的单纯疱疹病毒感染未成熟树突状细胞中自噬的抑制
737 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
单核细胞来源的树突状细胞（DC）由健康供体的白细胞分离产品制备。本研究已获得当地伦理委员会的批准（编号 4556）。本研究中的实验均遵循“埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学”伦理委员会的建议（编号 4556）。所有供体均签署了书面知情同意书，同意书内容符合《赫尔辛基宣言》的要求。
1. 不成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）的制备与处理
- 按照先前所述方法，从白细胞减少系统腔室（LRSCs）中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）。避免对PBMCs进行冷冻保存，应在分离后直接使用，以获得更高的树突状细胞（DC）产量。
- 按照先前所述方法，在T175细胞培养瓶中利用不同健康供体的PBMCs生成人树突状细胞（DCs）。简言之，每个细胞培养瓶中加入3.5亿至4亿个PBMCs，置于30 mL DC培养基（RPMI 1640不含L-谷氨酰胺，1% (v/v) AB型人血清（AB血清），100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素，0.4 mM L-谷氨酰胺，10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES））中，通过贴壁法分离单核细胞。1小时后，用RPMI 1640洗去非贴壁组分。加入新鲜DC培养基，并补充800 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和250 U/mL白细胞介素-4（IL-4），培养3天。
- 贴壁后第3天，每瓶细胞培养瓶中加入5 mL含GM-CSF和IL-4的新鲜DC培养基，终浓度分别为400 U/mL和250 U/mL，以诱导DC分化。
- 在贴壁后第4天，轻轻冲洗细胞培养瓶底部松散贴壁的未成熟树突状细胞（iDCs），以收获iDCs。重复此步骤2次。为生成成熟树突状细胞（mDCs），加入以下成分组成的成熟诱导混合液：GM-CSF（终浓度：40 U/mL），IL-4（终浓度：250 U/mL），白细胞介素-6（IL-6，终浓度：1000 U/mL），白细胞介素-1β（IL-1β，终浓度：200 U/mL），肿瘤坏死因子α（TNF-α，终浓度：10 ng/mL），前列腺素E2（PGE2；终浓度：1 μg/mL）。
- 贴壁后第6天（即使用细胞因子混合物诱导成熟后的第2天），冲洗细胞培养瓶底部的mDCs。重复此步骤两次。
注意：未成熟和成熟DCs可从同一供体在同一个细胞培养瓶中依次生成。具体操作为：(i) 分离出所需数量的iDCs；(ii) 使用步骤1.2.2中列出的细胞因子混合物诱导瓶中剩余细胞成熟。
- 将iDCs或mDCs连同相应的细胞培养基转移至50 mL离心管中。在300 × g 条件下离心5分钟，收集细胞。
- 每瓶细胞培养瓶用5–10 mL RPMI 1640轻柔重悬（即洗涤）DCs，并将相应的DC悬液合并至同一离心管中。
- 使用细胞计数板或其他方法确定细胞数量。操作iDCs时应避免温度变化，以降低表型改变的风险。
2. 通过流式细胞术分析监测表型成熟状态
- 将步骤 1.3.1 中的 iDCs 或 mDCs（0.5 × 106）转移至 1.5 mL 离心管中。在 3390 × g 条件下离心 1.5 分钟收集细胞。用 FACS 缓冲液（含 2% 胎牛血清 [FCS] 的 PBS）洗涤细胞一次。
- 将细胞重悬于 100 µL 抗体染色液（FACS 缓冲液）中，该溶液含有针对特定表面分子的荧光染料标记抗体。
- 使用以下抗体验证细胞纯度（CD3-FITC [异硫氰酸荧光素]、CD14-PE [藻红蛋白]）以及 DCs 的成熟状态（CD80-PacBlue [太平洋蓝]/-PE-Cy5 [藻红蛋白-青色素 5]、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7）。
- 在 100 µL FACS 缓冲液中准备一份未染色样本作为对照。
- 将细胞置于冰上避光染色 30 分钟。
- 随后用 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 3390 × g 条件下离心 1.5 分钟。
- 最后，将细胞重悬于 200 µL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术分析细胞。固定后的细胞可在 4°C 避光保存最多 2 天。
3. 通过电穿孔法将 FIP200-siRNA 转入未成熟树突状细胞以干扰 HSV-1 诱导的自噬流
注意：本siRNA电穿孔实验方案经Prechtel等（2007年）和Gerer等（2017年）的研究修改而来。
- 在贴壁后第3.5天，将iDCs（12 × 106）转移至50 mL离心管中。随后在300 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。同时，按照步骤2所述进行流式细胞术分析以监测成熟状态（使用Life/Dead violet替代CD80-PacBlue）。
- 用5 mL不含酚红的OptiMEM轻柔洗涤iDCs，并在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将iDCs轻柔重悬于200 µL不含酚红的OptiMEM中，调整细胞浓度至6 × 106/100 µL。切勿将细胞置于冰上，避免温度变化。操作应迅速进行，避免iDCs在不含酚红的OptiMEM中长时间孵育。
- 将75 pmol的FIP200特异性siRNA或作为对照的75 pmol随机序列siRNA加入4 mm电穿孔杯中，再加入100 µL细胞悬液（含6 × 106个细胞）。立即使用电穿孔仪I进行电脉冲处理，设置参数为：500 V，持续1 ms。
- 在正式实验前，根据制造商说明配制siRNA悬液，分装后储存于-20 °C。使用时冰上解冻并保持低温。在对样品进行电穿孔前，需先进行测试性脉冲。
- 电穿孔后，立即将iDCs转移至6孔板中，加入新鲜预热的DC培养基（补充40 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4）。将细胞接种至终浓度为1 × 106/mL，并放入培养箱中。切勿用液体冲洗电穿孔杯中的细胞。
- 48小时后，首先在显微镜下观察电穿孔后iDCs的形态。然后使用细胞刮刀收集细胞并转移至15 mL离心管中。用含0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）的1 mL PBS冲洗培养孔，并将冲洗液转移至相应离心管中。
- 随后，按以下步骤将每种siRNA处理条件下的6 × 106个iDCs进行分组。
- 取0.5 × 106个细胞，按照步骤2所述评估细胞成熟状态和活力。使用以下抗体：CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7以及Life/Dead violet。
- 取1 × 106个细胞用于Western blot分析，以验证FIP200特异性敲低效率。通过在3390 × g条件下离心1.5分钟，将细胞转移并收集至1.5 mL安全锁离心管中。制备细胞裂解液并进行Western blot分析。
- 剩余细胞（4.5 × 106）用于HSV-1感染实验。针对每种实验条件，将2.25 × 106个iDCs转移至2 mL离心管中，分别以感染复数（MOI）为2的HSV-1进行感染，或加入MNT缓冲液作为模拟对照。按所述方法进行感染操作。
- 感染后20小时（hpi），使用细胞刮刀收集细胞，并制备细胞裂解液用于Western blot分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4D-核转染核心单元（电穿孔装置 II） | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
| AB血清 | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | 树突状细胞培养 |
| ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
| Amaxa P3 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒 L（电穿孔试剂盒装置 II） | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
| Amersham ECL Prime 蛋白印迹检测试剂 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | 蛋白印迹检测 |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
| 抗小鼠IgG（小鼠，多克隆，HRP） | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | 蛋白印迹检测 |
| 抗兔IgG（山羊，多克隆，HRP） | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | 蛋白印迹检测 |
| BD FACS Canto II 流式细胞仪 | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
| Fastblot B44 转膜室 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
| CCR7（小鼠，Pe-Cy7） | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 克隆号：G043H7 |
| CD11c（小鼠，Pe-Cy5） | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 克隆号：B-ly6 |
| CD14（小鼠，PE） | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 克隆号：M5E2 |
| CD3（小鼠，FITC） | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 克隆号：UCHT1 |
| CD80（小鼠，V450） | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 克隆号：L307.4 |
| CD83（小鼠，APC） | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | 流式细胞术 稀释比例：1:200 克隆号：HB15e |
| CD86（小鼠，PE） | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | 流式细胞术 稀释比例：1:100 |
| EVOS FL 细胞成像系统 | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
| FIP200（兔） | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | 蛋白印迹检测 稀释比例：1:1000 克隆号：D10D11 |
| Gene Pulser II 装置（电穿孔装置 I） | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
| GM-CSF（4×10⁴ U/mL） | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
| HLA-DR（小鼠，APC-Cy7） | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | 流式细胞术 稀释比例：1:200 克隆号：L243 |
| HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | 树突状细胞感染 | |
| IL-1β（0.1×10⁶ U/mL） | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
| IL-4（1×10⁶ U/mL） | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
| IL-6（1×10⁶ U/mL） | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
| LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒 | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | 流式细胞术中活/死细胞染色 |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
| 氯化镁 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
| Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
| Neubauer 计数板 | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
| Nunc 细胞培养瓶（175.0 cm²） | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
| 多聚甲醛，16% | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
| PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
| PGE2（1 mg/mL） | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
| RestoreTM 蛋白印迹 stripping 缓冲液 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
| Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
| RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
| Roti-Load 1（4×） | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
| Rotiphorese Gel 30（37.5:1） | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
| RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
| TNF-α（10 μg/mL） | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
| Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
| 吐温20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
| Whatman 0.2 μm 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
| WhatmanTM 色谱纸 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |
