评估一种细菌免疫调节蛋白在小鼠模型中的抗肿瘤疗效

摘要

来源：Codolo, G. 等 疗效评估的 H. pylori 蛋白HP-NAP在原位小鼠模型中作为膀胱癌治疗工具的研究 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了一种在小鼠膀胱癌模型中评估幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白（Helicobacter pylori neutrophil-activating protein，简称 HP-NAP）抗肿瘤活性的技术。HP-NAP 与肿瘤细胞周围的中性粒细胞相互作用，促进促炎性细胞因子的产生，诱导初始 T 细胞分化为 1 型辅助性 T 细胞（Th1）和 1 型细胞毒性 T 细胞（Tc1）表型。Th1 和 Tc1 细胞分泌干扰素-γ，抑制肿瘤血管生成，并促进细胞毒性 T 细胞介导的肿瘤破坏，从而减小肿瘤体积。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 动物

1. 将 C57BL6/J 雌性小鼠在带微隔离过滤器的独立通风笼具中饲养至 8 周龄。
   注意：优先选用雌性小鼠，因其外泌尿生殖系统解剖结构使得导管插入操作较雄性更简便。

2. 细胞培养

1. 在添加了10%热灭活胎牛血清和50 µg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基中，于37 °C、湿润的含5%二氧化碳（CO₂）环境中培养小鼠膀胱移行细胞癌MB49细胞系。
2. 将MB49细胞在T-75培养瓶中培养至80%汇合度。消化后，重悬于150 μl磷酸盐缓冲液（PBS）中，细胞密度为0.5 × 10⁵ 至0.5 × 10⁶ 个细胞，用于小鼠体内移植。

3. 膀胱内肿瘤移植

1. 通过腹腔注射 zoletil 和 xylor 的混合麻醉剂（剂量分别为 33 mg/kg 和 20 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
2. 将动物置于仰卧位，并用透明胶带将其后肢固定在垫子上。足部需充分分开，以便尿道外口清晰可见且易于插入导管。
3. 注意：导管插入时，24 G 儿科静脉导管适用于 8 至 10 周龄的小鼠。导管的选择至关重要，以避免液体在尿道壁与导管之间泄漏。对于体型较大或年龄较大的小鼠，必须使用内径更大的导管。
4. 使用小型镊子夹住尿道外口的一侧边缘，并非常轻柔地向小鼠的“头部方向”扭转，以暴露尿道外口。
5. 取出导管内的金属内芯，将导管以 45° 角插入尿道，方向略微朝向小鼠的“尾部方向”。切勿强行插入导管；若遇到阻力，只需非常轻柔地旋转导管，直至其滑入尿道。当导管插入深度约为 0.5–0.8 cm 时，小心地将导管调整至与小鼠尾部平行，并完全插入。
6. 使用 1 ml 注射器，将针头插入导管，注入 200–300 μl 无菌 PBS 以冲洗膀胱内残留的尿液，并将所有液体从膀胱中吸出。
7. 注意：注入 PBS 时，膀胱会充盈，并在小鼠后肢之间出现可见的肿胀；这表明导管插入位置正确。大多数导管存在死腔体积，在计算注射量时必须予以考虑。
8. 使用无菌 1 ml 注射器，向膀胱内注入 200 μl 0.1 N 盐酸（HCl），使膀胱壁充分接触酸液。10 秒后，吸出全部酸液，并立即使用无菌注射器注入 200 μl 0.1 N 氢氧化钠（NaOH）进行中和。若注入细胞数量最多（0.5 × 10⁶），则无需进行酸化步骤。
9. 吸出所有残留液体，并立即用 300 µl 无菌 PBS 冲洗膀胱腔。
10. 通过抽吸排空膀胱，然后注入含有 MB49 细胞（数量范围为 0.5 × 10⁵ – 0.5 × 10⁶）的 150 μl PBS。保持注射器与导管连接，以防止细胞泄漏。建议用透明胶带将注射器固定在垫子上，以确保稳定。
11. 1 小时后，轻柔地将导管从小鼠尿道中拔出，并将小鼠置于笼中，在白炽 灯下保温直至苏醒：通常在处理结束后的 1 至 2 小时内苏醒。

4. 膀胱内递送 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）

1. 注意：在细胞接种后至少3天，即可开始治疗。
2. 按照步骤 3.1 至 3.4 所述进行插管。在此阶段，无需使用 HCl 灼烧膀胱壁。
3. 使用1 ml注射器，注入200–300 μl无菌PBS冲洗膀胱以去除残留尿液，并将膀胱内的所有液体吸出。
4. 向膀胱内注射每150 μl PBS含50 μg的HP-NAP。保持注射器与导管连接，以避免蛋白溶液泄漏。使用透明胶带将注射器固定在垫子上以确保稳固。
5. 1小时后，轻柔地从尿道中取出导管，将小鼠放回笼中，并置于白炽灯下 灯，直到他们醒来。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 雌性小鼠	Harlan Italy (意大利乌迪内)
MB49 细胞			由美国爱荷华大学卡弗医学院 O'Donnel 教授提供，爱荷华，美国
RPMI	Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X，需用无热原水稀释
细胞培养瓶	Becton Dickinson (美国新泽西州富兰克林湖)	353135
1 ml 注射器	Becton Dickinson	301358
胰蛋白酶	Life Technologies (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)
庆大霉素	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (意大利米兰)		2% 塞拉嗪
Zoletil	Virbac (法国卡罗斯)	3.59713E+11	5% 唑拉西泮 + 5% 替来他明
24G 导管	Terumo (意大利罗马)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (意大利米兰)	403871	液体
NaOH	JT Baker (美国宾夕法尼亚州中心谷)	10095011	粉末