使用病毒抗原特异性 T 细胞抑制乙型肝炎病毒复制

摘要

来源:Xiong， X. et al. 干细胞衍生的病毒 Ag 特异性 T 淋巴细胞抑制小鼠的 HBV 复制。J. Vis. Exp. （2019）。

该视频演示了一种使用人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 CD8+ T 细胞抑制乙型肝炎病毒 （HBV） 在小鼠体内复制的检测方法。这些用 HBV 特异性受体改造的 T 细胞被转移到转基因小鼠体内。然后将具有复制能力的 HBV 基因组质粒直接注射到肝脏中，使病毒 DNA 能够摄取。一旦病毒抗原由杂交 MHC-I 分子表达和呈递，工程化的 T 细胞就会识别并与这些复合物结合。这会触发细胞毒性分子的释放，导致 HBV 感染的肝细胞被破坏并抑制病毒复制。

方案

所有涉及动物模型的程序都已由当地
审查 机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会。所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 从 iPSC 生成病毒 Ag 特异性 CD8⁺ T 细胞（iPSC-CD8⁺ T 细胞）

1. 逆转录病毒构建体的创建
   注意:T 细胞受体 （TCR） α 和 β 基因与 2A 自切割序列有关。逆转录病毒载体 MSCV-IRES-DsRed （MiDR） 为 DsRed+。
   1. 将亚克隆 HBs183-191 （FLLTRILTI） 特异性 A2 限制性人鼠杂交 TCR （s183 TCR） 基因（Vα34 和 Vβ28）放入 MiDR 中，以创建 s183 MiDR 构建体（图 1A）。
2. 逆转录病毒转导
   注:Platinum-E （Plat-E） 细胞用于包装逆转录病毒（携带 s183 TCR 基因），将用于逆转录病毒转导。Plat-E 细胞是 293T 细胞基础的有效逆转录病毒包装细胞，其通过 EF1α 启动子通过独特的包装构建体开发，用于表达逆转录病毒结构蛋白，包括 gag、pol 和向向性环境。
   1. 在 100 mm 培养皿上，转染前 1 天，在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中，将 3 x 10⁶ 个 Plat-E 细胞接种在 8 mL 含有 10% 胎牛血清 （FCS） 的 DMEM 培养基中。
   2. 第 0 天，使用 DNA 转染试剂将 s183 MiDR 构建体转染到 Plat-E 细胞中。
   3. 第 1 天，将 1 x 10^{个 6} 个 iPSC（绿色荧光蛋白 [GFP]+）接种到明胶预包被的培养板中。
   4. 在第 2-3 天，从 Plat-E 细胞培养物中收集含逆转录病毒的上清液，在 1,6-二溴己烷溶液存在下用 s183 TCR 转导 iPSC。
   5. 第 4 天，胰蛋白酶消化 s183 TCR 基因转导的 iPSC，以 400 x g 离心 5 分钟，并将 3 × 10⁵ 个 iPSC 接种在预涂有 3 x 10⁶ 辐照 SNL76/7 （irSNL76/7） 饲养层细胞的 100 mm 培养皿中。
   6. 在汇合的第 5 天或第 6 天，用胰蛋白酶消化细胞，以 400 x g 离心 5 分钟，然后进行细胞分选。对活细胞设门，使用高速细胞分选仪对 GFP 和 DsRED 双阳性细胞（s183 TCR 基因转导的 iPSC）进行分选。与步骤 1.2.5 类似，在 irSNL76/7 饲养层细胞上共培养分选的细胞以备将来使用。
3. HBV 特异性 iPSC-CD8+ T 细胞的分化
   注:OP9-DL1/DL4 基质细胞过表达 Notch 配体 DL1 和 DL4，iPSC 与 iPSC 共培养可促进 Notch 信号介导的 T 细胞分化。
   1. 在含有 20% 胎牛血清 （FBS） 的最低α必需培养基 （MEM） 培养基中，在 OP9-DL1-DL4 细胞单层中培养 s183 TCR 基因转导的 iPSC （s183/iPSC）。在培养物中加入小鼠 FMS 样酪氨酸激酶 3 （Flt3） 配体（mFlt-3L;终浓度 = 5 ng/mL）。
   2. 第 0 天，将 0.5-1.0 x 10^{5 个} S183/iPSC 接种在先前用 OP9-DL1-DL4 细胞生长的 10 cm 培养皿中。验证 OP9-DL1-DL4 细胞是否处于 80%–90% 汇合的状态。
   3. 第 5 天，用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 iPSC，吸出 PBS，将其添加到 4 mL 0.25% 胰蛋白酶中，并在 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。然后，添加补充 8 mL iPSC 培养基以结束胰蛋白酶消化。积累所有含有细胞的消化液，并在 15–30 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。
   4. 吸出上清液并将细胞重悬于 10 mL iPSC 培养基中。将细胞悬液转移到新的 10 cm 培养皿中，并在培养箱中于 37 °C 孵育 30 分钟。
   5. 30 分钟后，收集含有漂浮细胞的 iPSC 培养基。将细胞悬液通过 70 μm 细胞过滤器并计算细胞数量。
   6. 如步骤 1.3.1.
      中所述，在先前生长的 OP9-DL1-DL4 细胞的培养皿中接种 5 x 10⁵ 个细胞 注意:对于 T 细胞分化，每 2-3 天，iPSC 衍生的细胞需要用新鲜的 OP9-DL1-DL4 细胞层重新接种。
4. 评估
   1. 分化 iPSC 的形态变化
      在
      1. 不同的日子里在显微镜下观察细胞。
         注意:到第 5 天，菌落具有类似中胚层的特征，表现出类似于人类真皮成纤维细胞的经典纺锤形形态，并在体外持续生长。到第 8 天，小的圆形细胞簇开始出现。
   2. 通过流式细胞术分析分化的 iPSC
      1. 在共培养的不同日子里，如前所述分析 iPSC 衍生的细胞（图 1B，C）。
   3. 分化 iPSC 的功能分析
      1. 在共培养的第 28 天，通过收获漂浮细胞从培养物中收集 iPSC-CD8+ T 细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化剩余细胞，重悬于 8 mL iPSC 培养基中，在 15–30 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟，去除培养基，然后将细胞重悬于 10 mL 培养基中。
      2. 将重悬的细胞在 37 °C 培养箱中的新鲜 10 cm 培养皿中放置 30 分钟，然后组装漂浮细胞。然后用冷 PBS 冲洗细胞一次。
      3. 将来自 H-2 I 类敲除、HLA-A2.1 转基因 （HHD） 小鼠脾脏的 3 x 10⁶ T 细胞耗尽的脾细胞 （^CD4-CD8-） 与 5 μM s183 肽 （FLLTRILTI） 在 200 μL 培养基中在 4 °C 下孵育 30 分钟。
      4. 产生 iPSC-CD8⁺ T 细胞与用 s183 肽脉冲的脾细胞的混合物（T 细胞:脾细胞 = 1:4;使用 0.75 x 10⁶ T 细胞）。将细胞混合物在 37 °C 下在 CO₂ 培养箱中孵育 40 小时。在最后 7 小时内，向培养物中加入 4 μL 稀释的布雷菲德菌素 A（终浓度为 1,000x，将在 1x 培养基中稀释）以阻断细胞活化过程中的运输过程。
      5. 如前所述，对细胞进行染色并对细胞内干扰素-γ （IFN-γ） 进行流式细胞术分析（图 2）。

2. 通过 HBV 质粒的流体动力学递送诱导 HBV 复制

注意:pAAV/HBV1.2 构建体的生成如前所述。HBV 1.2 完整 DNA 掺入载体 pAAV 中。

1. HBV 质粒通过尾静脉的流体动力学递送
   1. 使用加热灯在笼子中加热 HHD 小鼠 5 分钟，以扩张尾静脉。
   2. 用束缚器拘留动物，并用 70% 乙醇喷雾清洁老鼠尾巴。
   3. 将质粒递送到肝脏中。
   4. 使用测量秤测量小鼠的体重。
   5. 在 8% 当量体重的 PBS 中稀释 10 μg HBV 质粒（例如，20 g 小鼠为 1.6 mL）。将稀释的质粒装入 3 mL 注射器中，× 26 G 1⁄2" （0.45 × 12 mm） 皮下注射针头。
   6. 在尾部的中间三分之一找到两条侧尾静脉中的一条，然后将针头定位到任一侧静脉中。在 3 - 5 秒内通过尾静脉施用含有 HBV 质粒的注射剂。
2. 定量检测感染小鼠血清中的病毒血症
   注意:HBV 复制发生在小鼠血清的第 3-35 天。DNA 复制在第 7 天达到峰值并逐渐减少。HBV DNA 直到第 35 天才从血清中清除。
   1. 从感染小鼠中收集血清
      在
      1. 感染后 3、5、7 和 10 天，通过在 1.5 mL 微量离心管中眶后出血从每只小鼠的微量离心管中收集大约 0.1 mL 的血液，然后在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。
      2. 将样品在 4 °C 下以 6,000 x g 离心 15 分钟，离心后收集血清上清液。
   2. 按照制造商的建议，使用市售的 DNA 提取试剂盒从血清中纯化 DNA。简而言之，在硅胶柱中裂解细胞，进行洗涤，并通过向洗脱柱中加入 100% 乙醇并以 6000 x g 离心 1 分钟来提取 DNA。在 50 μL 不含 RNase 的水中洗脱 DNA。
   3. 使用洗脱液中的 100 ng HBV DNA 进行实时荧光定量 PCR 分析。使用以下引物和探针:正向 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3';反向 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3';探针 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. 使用含有 HBV 基因组的质粒 （pAAV/HBV1.2） 作为标准曲线，并以 10 μL 的总体积进行实时 PCR（图 3）。
   4. 设置总体积为 10 μL 的 PCR 反应，如表 1 所示。
   5. 在热循环仪中设置 PCR 程序，如表 2 所示。变性/退火的程序温度转变速率为 20 °C/s，延伸为 5 °C/s。测量每个循环退火阶段结束时的荧光，以进行实时 PCR 监测。

3. ACT 减少病毒 Ag 特异性 iPSC-CD8+ T 细胞的 HBV 复制

1. 过继细胞转移 （ACT）
   1. 如 1.3 节所述，在 mFlt-3L 和 mIL-7 存在下，在 OP9-DL1-DL4 基质细胞上分化 s183/iPSC （1.3.7） 8 天。
   2. 第 22 天，用胰蛋白酶从 10 cm 板中收集 iPSC-CD8 + T 细胞，然后将每个 10 cm 板洗涤并重悬于 10 mL 新鲜培养基中。将细胞加入新的10 cm板中，然后放回培养箱中30分钟，如第1.3节所述。30 分钟后，收集漂浮细胞。
   3. 使用 70 μm 尼龙过滤器通过细胞以消除细胞簇并计数细胞数量。在冷 PBS 溶液中使细胞适应 1.5 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度，并在需要时使用 70 μm 尼龙过滤器通过细胞以再次消除细胞簇。将细胞放在冰上直到 ACT。
   4. 通过尾静脉将 200 μL 细胞悬液（3 x 10⁶ 个细胞）注射到 4-6 周龄的 HHD 小鼠中。
2. 诱导 HBV 复制
   1. 在细胞转移后的第 14 天，如第 2.1 节所述，通过尾静脉进行 HBV 质粒的流体动力学递送。

表 1:PCR 反应体积

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> DNA 模板 2 毫升 DNA 主杂交混合物（（Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液、10 mM MgCl₂ 和 dNTP 混合物） 1 毫升 25 毫米氯化镁₂ 0.8 毫升 0.3 μM 探针 3 毫升 每种引物 5 μM 3.2 毫升 总 10 毫升

表 2:PCR 程序

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 变性 温度
95 摄氏度 时间
5 秒 退火 53 摄氏度 10 秒 外延 72 摄氏度 20 秒 5 °摄氏度

结果

图 1:HBV 病毒抗原特异性 iPSC-CD8⁺ T 细胞的产生。

小鼠 iPSC 使用以下逆转录病毒构建体转导:HBs183-91 TCR （MiDR-s183 TCR） 或 OVA257-264 TCR （MiDR-OVA TCR），转导的 iPSC 与 OP9-DL1/DL4 基质细胞共培养用于 T 系分化。（A） 表达 s183 特异性 TCR 的逆转录病毒构建体 MiDR-s183 TCR 的示意图。Ψ = 封装信号;2A = 小核糖核酸病毒自裂解 2A 序列;LTR = 长末端重复。（B） T 细胞分化在第 0 、 7 、 14 和 22 天的形态。（C） 第 28 天 iPSC 来源细胞的流式细胞术分析。如图所示，对 CD3 + CD8 + 细胞（左）设门并分析 CD8 和 TCRVβ28 的表达（右）。显示的数...

材料