利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

摘要

来源：Xiong, X., 等 干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞在小鼠中抑制乙型肝炎病毒复制。J. Vis. Exp. (2019)。

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+ T细胞在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验。这些T细胞经基因工程改造，表达HBV特异性受体，被移植至转基因小鼠体内。随后，将具有复制能力的HBV基因组质粒直接注射到肝脏中，以实现病毒DNA的摄取。当病毒抗原由杂合MHC-I分子呈递并表达后，经改造的T细胞可识别并结合这些复合物，进而触发细胞毒性分子的释放，导致HBV感染的肝细胞被破坏，从而抑制病毒复制。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构的审查
机构动物护理委员会及JoVE兽医审查委员会。所有涉及样本采集的程序均依照本机构IRB指南进行。

1. 由iPSCs生成病毒抗原特异性CD8⁺ T细胞（iPSC-CD8⁺ T细胞）

1. 逆转录病毒载体的构建
   注意：T细胞受体（TCR）α和β基因通过2A自剪切序列连接。逆转录病毒载体MSCV-IRES-DsRed（MiDR）为DsRed阳性。
   1. 将针对HBs183-191（FLLTRILTI）表位、由HLA-A2限制性的人-鼠嵌合TCR（s183 TCR）基因（Vα34和Vβ28）亚克隆至MiDR载体中，构建s183 MiDR载体（图1A）。
2. 逆转录病毒感染
   注意：使用Platinum-E（Plat-E）细胞包装携带s183 TCR基因的逆转录病毒，用于后续的逆转录病毒转导。Plat-E细胞是基于293T细胞开发的高效逆转录病毒包装细胞系，通过EF1α启动子驱动独特的包装结构，表达包括gag、pol和嗜同种env在内的逆转录病毒结构蛋白。
   1. 转染前一天，在100 mm培养皿中接种3 × 10⁶个Plat-E细胞，加入8 mL含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。
   2. 第0天，使用DNA转染试剂将s183 MiDR载体转染至Plat-E细胞中。
   3. 第1天，将1 × 10⁶个诱导多能干细胞（iPSCs，绿色荧光蛋白[GFP]阳性）接种于明胶预包被的培养板中。
   4. 第2–3天，收集含逆转录病毒的Plat-E细胞上清液，在1,6-二溴己烷溶液存在下用于感染iPSCs，导入s183 TCR基因。
   5. 第4天，用胰蛋白酶消化已转导s183 TCR基因的iPSCs，400 x g离心5分钟，将3 × 10⁵个iPSCs接种至预先铺有3 × 10⁶个经辐照处理的SNL76/7（irSNL76/7）饲养层细胞的100 mm培养皿中。
   6. 当细胞在第5或第6天达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化细胞，400 x g离心5分钟，进行细胞分选。以活细胞为门控，使用高速细胞分选仪分选GFP与DsRED双阳性的细胞（即成功转导s183 TCR基因的iPSCs）。参照步骤1.2.5，将分选后的细胞与irSNL76/7饲养层细胞共培养，以备后续使用。
3. HBV特异性iPSC来源CD8+ T细胞的分化
   ​注意：OP9-DL1/DL4基质细胞过表达Notch配体DL1和DL4，与iPSCs共培养可促进Notch信号通路介导的T细胞分化。
   1. 将转导了s183 TCR基因的iPSCs（s183/iPSCs）在表达DL1和DL4的OP9细胞单层上培养，培养基为含20%胎牛血清（FBS）的α-最低必需培养基（MEM），并添加小鼠FMS样酪氨酸激酶3（Flt3）配体（mFlt-3L；终浓度=5 ng/mL）。
   2. 第0天，将0.5–1.0 × 10⁵个s183/iPSCs接种至已长满OP9-DL1-DL4细胞的10 cm培养皿中。确保OP9-DL1-DL4细胞处于80%–90%汇合状态。
   3. 第5天，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗iPSCs，吸除PBS后加入4 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C培养箱中孵育10分钟。随后加入8 mL补充培养基终止消化。收集全部含细胞的消化液，于15–30 °C下400 x g离心5分钟。
   4. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL iPSC培养基中，转移至新的10 cm培养皿，于37 °C培养箱中孵育30分钟。
   5. 30分钟后，收集含有悬浮细胞的培养基，经70 μm细胞筛过滤，计数细胞数量。
   6. 将5 × 10⁵个细胞接种至先前已长满80%–90%汇合度OP9-DL1-DL4细胞的培养皿中，操作同步骤1.3.1。
      注意：为促进T细胞分化，每2–3天需将iPSC来源的细胞重新接种于新鲜的OP9-DL1-DL4细胞层上。
4. 评估
   1. iPSCs分化过程中的形态学变化
      1. 在不同时间点于显微镜下观察细胞形态。
         注意：至第5天，细胞集落呈现中胚层样特征，表现为典型的纺锤形形态，类似于人皮肤成纤维细胞，并可在体外持续增殖。至第8天，开始出现小的圆形细胞簇。
   2. 通过流式细胞术分析iPSCs的分化情况
      1. 在共培养的不同时间点，按先前所述方法分析iPSC来源的细胞（图1B,C）。
   3. iPSCs分化细胞的功能分析
      1. 共培养第28天，通过收集悬浮细胞并用0.25%胰蛋白酶消化残留贴壁细胞，从培养物中收集iPSC-CD8+ T细胞，重悬于8 mL iPSC培养基中，于15–30 °C下400 x g离心5分钟，弃去上清，再将细胞重悬于10 mL培养基中。
      2. 将重悬的细胞转移至新鲜的10 cm培养皿中，在37 °C培养箱中孵育30分钟以收集悬浮细胞，随后用冷PBS洗涤一次。
      3. 取来自H-2 I类分子敲除、HLA-A2.1转基因（HHD）小鼠脾脏的T细胞耗竭型脾细胞（CD4^-CD8^-）3 × 10⁶个，加入200 μL培养基，与5 µM s183肽段（FLLTRILTI）在4 °C孵育30分钟。
      4. 将iPSC-CD8⁺ T细胞与经s183肽段致敏的脾细胞混合（T细胞:脾细胞 = 1:4；使用0.75 × 10⁶个T细胞），在CO₂培养箱中37 °C孵育40小时。最后7小时加入4 µL稀释的布雷菲德菌素A（终浓度为1,000倍稀释液，将在1倍培养基中稀释），以阻断细胞活化过程中的运输途径。
      5. 按先前所述方法对细胞进行染色，并进行细胞内干扰素-γ（IFN-γ）的流式细胞术分析（图2）。

通过水动力法递送HBV质粒诱导HBV复制

注意：pAAV/HBV1.2 载体的构建如前所述。HBV 1.2 完整 DNA 已插入至 pAAV 载体中。

1. 通过尾静脉进行HBV质粒的水动力递送
   1. 使用加热灯在笼内对HHD小鼠加热5分钟，以扩张尾静脉。
   2. 使用固定器固定动物，并用70%乙醇喷雾清洁小鼠尾巴。
   3. 将质粒递送至肝脏。
   4. 使用电子天平测量小鼠体重。
   5. 将10 μg HBV质粒溶于相当于体重8%体积的PBS中（例如，20 g小鼠使用1.6 mL）。将稀释后的质粒加入3 mL注射器中，并安装26 G × 1⁄2″（0.45 × 12 mm）的皮下注射针头。
   6. 在尾部中段三分之一处定位两条侧尾静脉之一，将针头插入任一侧静脉，并在3–5秒内完成含HBV质粒的尾静脉注射。
2. 感染小鼠血清中病毒血症的定量
   注意： HBV在小鼠血清中的复制发生在感染后第3至35天。DNA复制在第7天达到峰值，随后逐渐下降。直到第35天，血清中仍可检测到HBV DNA。
   1. 采集感染小鼠的血清
      1. 在感染后第3、5、7和10天，通过眶后静脉丛采血法，从每只小鼠采集约0.1 mL血液至1.5 mL微量离心管中，室温（RT）孵育20分钟。
      2. 在4 °C条件下以6,000 x g离心15分钟，收集离心后的血清上清液。
   2. 使用市售DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从血清中纯化DNA。简要步骤如下：在基于硅胶膜的离心柱中裂解细胞，进行洗涤，然后向洗脱柱中加入100%乙醇，在6,000 x g下离心1分钟以提取DNA。最后用50 µL无RNase水洗脱DNA。
   3. 取洗脱液中的100 ng HBV DNA用于实时PCR分析。使用以下引物和探针：上游引物 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'；下游引物 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'；探针 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'。
      1. 以含有HBV基因组的质粒（pAAV/HBV1.2）作为标准曲线模板，在总反应体积为10 μL的条件下进行实时PCR（图3）。
   4. 按照 表1 所示设置总反应体积为10 μL的PCR反应体系。
   5. 按照 表2 所示在热循环仪中设置PCR程序。变性/退火阶段的升温速率为20 °C/s，延伸阶段为5 °C/s。每个循环退火阶段结束时检测荧光信号，用于实时PCR监测。

3. 利用病毒抗原特异性iPSC-CD8+ T细胞的过继性细胞治疗抑制HBV复制

1. 过继性细胞转移（ACT）
   1. 如第1.3节所述，在OP9-DL1-DL4基质细胞上，在mFlt-3L和mIL-7存在条件下，将s183/iPSCs（1.3.7）诱导分化8天。
   2. 第22天，用胰酶从10 cm培养皿中收集iPSC-CD8+ T细胞，洗涤后将每块10 cm培养皿的细胞重悬于10 mL新鲜培养基中。将细胞转移至新的10 cm培养皿中，放回培养箱孵育30分钟（操作同第1.3节）。30分钟后，收集悬浮细胞。
   3. 使用70 μm尼龙滤网过滤细胞，以去除细胞团块，并计数细胞数量。将细胞调整至1.5 × 10⁷ 个细胞/mL的浓度，置于冰上预冷的PBS溶液中；如需要，再次通过70 μm尼龙滤网过滤以去除细胞团块。细胞在ACT前保持冰上保存。
   4. 通过尾静脉向4–6周龄的HHD小鼠注射200 μL细胞悬液（含3 × 10⁶ 个细胞）。
2. 诱导HBV复制
   1. 细胞转移后第14天，通过尾静脉进行水动力法递送HBV质粒，操作如第2.1节所述。

表1：PCR反应体积

DNA 模板	2 ml
DNA 主杂交混合液（包含 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液、10 mM MgCl2 和 dNTP 混合物）	1 ml
25 mM MgCl2	0.8 ml
0.3 μM 探针	3 ml
每种引物 5 μM	3.2 ml
总量	10 ml

表2：PCR程序

变性	温度 95 °C	时间 5 s
退火	53 °C	10 s
延伸	72 °C	20 s
	5 °C

结果

图1：HBV病毒抗原特异性iPSC-CD8⁺ T细胞的生成。

小鼠iPSCs通过以下逆转录病毒载体进行转导：HBs183-91 TCR（MiDR-s183 TCR）或OVA257–264 TCR（MiDR-OVA TCR），转导后的iPSCs与OP9-DL1/DL4基质细胞共培养以诱导T细胞谱系分化。（A）表达s183特异性TCR的逆转录病毒载体MiDR-s183 TCR的示意图。Ψ = 包装信号；2A = 鼻病毒自切割2A序列；LTR = 长末端重复序列。（B）T细胞分化过程中第0、7、14和22天的形态学表现。（C）第28天iPSC来源细胞的流式细胞术分析。CD...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HHD 小鼠	法国巴黎巴斯德研究所		H-2 I 类基因敲除、HLA-A2.1 转基因（HHD）小鼠
iPS-MEF-Ng-20D-17	理化学研究所细胞库	APS0001
SNL76/7	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	SCRC-1049
OP9	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	CRL-2749
pAAV/HBV1.2 质粒	陈培哲博士（中国台湾国立台湾大学医院）		HBV DNA 构建体
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 特异性 TCR 基因	Adam J Gehring 博士（加拿大安大略省多伦多综合医院研究所）		FLLTRILTI 特异性、A2 限制性人-鼠嵌合 TCR 基因（Vα34 和 Vβ28）
OVA257–264 特异性 TCR 基因	Dario A. Vignali 博士（美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学）		SIINFEKL 特异性、H-2Kb 限制性 TCR 基因
抗 CD3 (17A2) 抗体	Biolegend	100236
抗 CD44 (IM7) 抗体	BD Pharmingen	103012
抗 CD4 (GK1.5) 抗体	Biolegend	100408
抗 CD8 (53-6.7) 抗体	Biolegend	100732
抗 IFN-γ (XMG1.2) 抗体	Biolegend	505810
抗 TNF-α (MP6-XT22) 抗体	Biolegend	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
抗 HBs 抗体	Thermo Fisher	MA5-13059
ACK 裂解缓冲液	Lonza	10-548E
布雷菲德菌素 A	Sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
FACSAria Fusion 细胞分选仪	BD	656700
明胶	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE 五聚体	Proimmune	F027-4A - 27
HRP 标记的抗小鼠二抗	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
核酸酶 S7	Roche	10107921001
多聚甲醛	MilliporeSigma	P6148-500G	注意：致敏性、致癌性、有毒
破膜缓冲液	Biolegend	421002
聚凝胺	MilliporeSigma	107689
含 DAPI 的 ProLong™ Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36931
QIAamp MinElute 病毒旋转柱试剂盒	Qiagen	57704