利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

摘要

来源：Xiong, X., 等 干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞在小鼠中抑制乙型肝炎病毒复制。J. Vis. Exp. (2019)。

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+ T细胞在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验。这些T细胞经基因工程改造，表达HBV特异性受体，被移植至转基因小鼠体内。随后，将具有复制能力的HBV基因组质粒直接注射到肝脏中，以实现病毒DNA的摄取。当病毒抗原由杂合MHC-I分子呈递并表达后，经改造的T细胞可识别并结合这些复合物，进而触发细胞毒性分子的释放，导致HBV感染的肝细胞被破坏，从而抑制病毒复制。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构的审查
机构动物护理委员会及JoVE兽医审查委员会。所有涉及样本采集的程序均依照本机构IRB指南进行。

1. 由iPSCs生成病毒抗原特异性CD8⁺ T细胞（iPSC-CD8⁺ T细胞）

1. 逆转录病毒载体的构建
   注意：T细胞受体（TCR）α和β基因通过2A自剪切序列连接。逆转录病毒载体MSCV-IRES-DsRed（MiDR）为DsRed阳性。
   1. 将针对HBs183-191（FLLTRILTI）表位、由HLA-A2限制性的人-鼠嵌合TCR（s183 TCR）基因（Vα34和Vβ28）亚克隆至MiDR载体中，构建s183 MiDR载体（图1A）。
2. 逆转录病毒感染
   注意：使用Platinum-E（Plat-E）细胞包装携带s183 TCR基因的逆转录病毒，用于后续的逆转录病毒转导。Plat-E细胞是基于293T细胞开发的高效逆转录病毒包装细胞系，通过EF1α启动子驱动独特的包装结构，表达包括gag、pol和嗜同种env在内的逆转录病毒结构蛋白。
   1. 转染前一天，在100 mm培养皿中接种3 × 10^6<....

结果

图1：HBV病毒抗原特异性iPSC-CD8⁺ T细胞的生成。

小鼠iPSCs通过以下逆转录病毒载体进行转导：HBs183-91 TCR（MiDR-s183 TCR）或OVA257–264 TCR（MiDR-OVA TCR），转导后的iPSCs与OP9-DL1/DL4基质细胞共培养以诱导T细胞谱系分化。（A）表达s183特异性TCR的逆转录病毒载体MiDR-s183 TCR的示意图。Ψ = 包装信号；2A = 鼻病毒自切割2A序列；LTR = 长末端重复序列。（B）T细胞分化过程中第0、7、14和22天的形态学表现。（C）第28天iPSC来源细胞的流式细胞术分析。CD.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HHD 小鼠	法国巴黎巴斯德研究所		H-2 I 类基因敲除、HLA-A2.1 转基因（HHD）小鼠
iPS-MEF-Ng-20D-17	理化学研究所细胞库	APS0001
SNL76/7	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	SCRC-1049
OP9	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	CRL-2749
pAAV/HBV1.2 质粒	陈培哲博士（中国台湾国立台湾大学医院）		HBV DNA 构建体
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 特异性 TCR 基因	Adam J Gehring 博士（加拿大安大略省多伦多综合医院研究所）		FLLTRILTI 特异性、A2 限制性人-鼠嵌合 TCR 基因（Vα34 和 Vβ28）
OVA257–264 特异性 TCR 基因	Dario A. Vignali 博士（美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学）		SIINFEKL 特异性、H-2Kb 限制性 TCR 基因
抗 CD3 (17A2) 抗体	Biolegend	100236
抗 CD44 (IM7) 抗体	BD Pharmingen	103012
抗 CD4 (GK1.5) 抗体	Biolegend	100408
抗 CD8 (53-6.7) 抗体	Biolegend	100732
抗 IFN-γ (XMG1.2) 抗体	Biolegend	505810
抗 TNF-α (MP6-XT22) 抗体	Biolegend	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
抗 HBs 抗体	Thermo Fisher	MA5-13059
ACK 裂解缓冲液	Lonza	10-548E
布雷菲德菌素 A	Sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
FACSAria Fusion 细胞分选仪	BD	656700
明胶	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE 五聚体	Proimmune	F027-4A - 27
HRP 标记的抗小鼠二抗	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
核酸酶 S7	Roche	10107921001
多聚甲醛	MilliporeSigma	P6148-500G	注意：致敏性、致癌性、有毒
破膜缓冲液	Biolegend	421002
聚凝胺	MilliporeSigma	107689
含 DAPI 的 ProLong™ Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36931
QIAamp MinElute 病毒旋转柱试剂盒	Qiagen	57704