一种用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞疗法

摘要

来源：Haque, M. 等，干细胞来源的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞的开发。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种用于小鼠自身免疫性关节炎的细胞治疗法。将表达卵清蛋白特异性受体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的调节性T细胞，与乳化于佐剂中的甲基化牛血清白蛋白（mBSA）共同注射。小鼠抗原呈递细胞（APCs）对mBSA进行加工并将其呈递给T细胞，从而促进T细胞活化并迁移至膝关节滑膜。后续注射在左膝关节仅使用mBSA，而在右膝关节则联合使用mBSA和卵清蛋白。在左膝关节，针对mBSA的免疫反应引发关节炎；而在右膝关节，调节性T细胞与卵清蛋白相互作用，减轻炎症反应，从而改善关节炎症状。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 体内 自身免疫性关节炎的成熟与抑制

1. 通过将OT-II T细胞受体（TCR）基因和叉头框蛋白3（FoxP3）亚克隆到与自切割肽2A连接的MiDR质粒中，构建用于逆转录病毒转导的MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3载体。
2. 使用Plat E细胞作为包装细胞系，对诱导性多能干细胞（iPSCs）进行逆转录病毒转导。
3. 体内分化及小鼠关节炎诱导。
   1. 在OP9-DL1-DL4-I-A^b基质细胞上，联合细胞因子mFlt-3L和mIL-7，对转导了OT-II TCR/FoxP3的iPSCs（OT-II-FoxP3/iPSCs）、转导FoxP3的iPSCs以及转导DsRed的iPSCs进行为期8天的分化。
   2. 第0天，使用OP-9培养基（含20%胎牛血清（FCS）和2.2 g/L碳酸氢钠的α-MEM培养基），以不低于10⁴ 个细胞/cm²的密度接种OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞。每10 cm培养皿接种1 × 10⁶个细胞。
   3. 第3天，当OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞达到80–90%汇合度时，吸除培养基，并在OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞上接种0.5–1 × 10⁵个iPSCs，使用OP-9培养基。
      ​注意：此步骤建立iPSCs与OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞的共培养体系，定义为分化的第0天。
   4. 第5天，用吸管吸除10 cm培养皿中的培养基，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再吸除PBS。加入4 ml 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟。再加入8 ml iPSC培养基终止消化，重悬细胞后，在室温下以400 × g离心5分钟。
      1. 吸除上清液，将细胞重悬于10 ml iPSC培养基中。将重悬的细胞接种至新的10 cm培养皿中，放回培养箱孵育30分钟。
         ​注意：去除OP9-DL1-DL4-I-A^b饲养层细胞，保留正在分化的iPSCs于培养基中。持续培养OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞，使其保持80–90%汇合度，用于后续共培养。
      2. 30分钟后，收集悬浮细胞，经70 µm细胞筛过滤，并用血细胞计数板计数。
   5. 将5 × 10⁵个iPSCs接种至新鲜的、80–90%汇合的OP9-DL1-DL4-I-A^b细胞上，使用OP9培养基，并补充终浓度为5 ng/ml的mFlt-3L。
   6. 将三种细胞均从10 cm培养皿中胰酶消化，分别将每个培养皿的细胞重悬于10 ml新鲜培养基中，接种至新的10 cm培养皿，放回培养箱孵育30分钟。30分钟后，收集悬浮细胞。
   7. 将细胞通过70 µm细胞筛以去除细胞团块，用血细胞计数板计数。用冷PBS将细胞调整至1.5 × 10⁷ 个细胞/ml的浓度，必要时再次过滤。细胞置于冰上保存，直至进行过继性细胞转移至小鼠体内。
   8. 通过尾静脉向三组4–6周龄雌性C57BL/6小鼠分别注射200 µl细胞悬液（含3 × 10⁶个细胞）。
   9. 细胞转移后第10天，使用1 ml注射器在小鼠尾根部皮下注射100 µg甲基化牛血清白蛋白（mBSA）与弗氏完全佐剂的乳化液。
   10. 第17天，使用异氟烷麻醉机对小鼠进行麻醉。诱导麻醉使用4–5%异氟烷，维持麻醉使用1–2%异氟烷。通过关节内注射，在左膝关节注射含20 µg mBSA的10 µl PBS，在右膝关节注射含20 µg mBSA和100 µg全卵白蛋白（OVA）的10 µl PBS以诱导关节炎。关节炎发生后，可在垫料中放置食物和凝胶包。小鼠将被实施安乐死的标准包括：体况评分（BCS）为2/5或濒死状态、严重恶病质和/或持续卧床（持续24小时），以及关节炎严重程度评分为4分。评分为4分时，表现为红斑和严重肿胀累及踝关节、足部及脚趾，或肢体发生关节强直。
4. 对转导OT-II TCR/FoxP3的iPSCs进行表征。
   1. 使用荧光显微镜（20X）观察未固定的活体DsRed⁺ GFP⁺细胞。
   2. 通过Western blot和流式细胞术检测基因整合与表达情况。
5. 关节炎抑制实验
   1. 在诱导关节炎前，使用数显卡尺测量小鼠双膝的肿胀程度，以建立基线值。
   2. 按照步骤（1.3.1–1.3.10）进行关节炎诱导和调节性T细胞（Treg）转移。Treg转移后，使用数显卡尺测量小鼠膝关节。
   3. 计算膝关节直径的增加百分比：增加百分比 = （第1天膝关节直径 – 第0天膝关节直径）/ 第0天膝关节直径。
6. 通过组织学方法评估膝关节破坏程度及炎症细胞浸润情况（图1）。
   1. 关节炎诱导后第7天，通过吸入二氧化碳（CO₂）并辅以颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。使用电动剃毛器去除膝部毛发，并通过手术切除膝关节。
   2. 使用钝头剪刀在后肢做切口，横切大腿至踝部皮肤，剥离皮肤以暴露肌肉组织。小心去除腿部肌肉，避免损伤膝关节。
      1. 在骨盆/髋关节上方切断后肢，并使用锋利的解剖剪刀切断胫骨。
   3. 将膝关节置于4%甲醛中固定48小时。使用2.5 M甲酸进行脱钙；用二甲苯冲洗三次，每次3分钟；用100%乙醇冲洗两次；用95%乙醇冲洗两次；用去离子水冲洗两次，每次2分钟；再用1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）进行脱钙处理。在亚沸温度（90 °C）下处理20分钟。
   4. 取出双侧膝关节，用10%甲醛固定，使用Formical-4进行钙化处理。将组织包埋于石蜡中，切片厚度为4 µm，进行苏木精-伊红（H & E）染色或番红O染色，并在显微镜下观察。

结果

图 1： 抗原特异性 iPSC-Treg 的过继转移可改善小鼠 AIA。 将小鼠 iPSCs 转导逆转录病毒构建体 MiDR、MiDR-FoxP3 或 MiDR-TCR-FoxP3，并在 OP9-DL1/DL4/I-A^b 细胞上共培养。第 7 天，将基因转导的细胞（3 × 10⁶/只小鼠）过继转移至已建立 AIA 的雌性 C57BL/6 小鼠体内，细胞转移两周后诱导关节炎。关节炎诱导次日，通过测量膝关节直径监测关节炎严重程度。（A-C） 膝关节直径增加百分比。膝关节直径的增加基于每只小鼠在第 0 天注射前的注射前膝关节直径进行计算。关节炎评分采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6j 小鼠	Jackson Laboratory	664
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
mBSA	Sigma	A7906
卵清蛋白	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
尾静脉固定器	Braintree scientific	RTV 150-STD
多聚甲醛	Sigma	P6148-500G	注意：致敏性、致癌性、 毒性