一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

摘要

来源：Riccione, K.，等。在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 脾切除与T细胞制备

第0天：

1. 将 10 ml T 细胞培养基（TCM）倒入 50 ml 锥形管中，并置于冰上，用于脾脏收集。
2. 按照美国兽医协会（AVMA）指南，通过 CO₂ 窒息法及二次断头法处死适量动物：将动物放入笼中，以每分钟 10–30% 笼体积的流速通入 CO₂（每次最多可同时处死 5 只动物），直至呼吸停止并持续两分钟。将动物从 CO₂ 室中取出并进行断头处理。
   注意：一只 6–12 周龄雌性 C57BL/6 小鼠的脾脏可获得约 4.5–5 × 10⁷ 个脾细胞。本实验中将采集 4 只小鼠的脾脏，以获得约 200 × 10⁶ 个细胞。
3. 将小鼠右侧朝上平放，并用 70% 乙醇喷洒消毒。用镊子夹住左侧肋骨下方的一小片皮肤，用剪刀剪开一个小切口。剥离皮肤后，小心用镊子夹起腹膜的一小片褶皱，剪开一个小口。
4. 脾脏为一细长、深红色、类似扁豆状的小器官；用镊子轻柔夹住脾脏，剪除周围结缔组织将其摘除。将摘除的脾脏放入盛有 10 ml TCM 并置于冰上的锥形管中。<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刀豆球蛋白 A	Sigma Aldrich	C2010	非特异性有丝分裂原，用于诱导 T 细胞增殖和病毒转导
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	T 细胞培养基
牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分—标准级	Gemini Bio Products	700-100P	阻断逆转录病毒与连环蛋白包被板之间的非特异性结合
Pharm Lyse（10 倍浓缩液）	BD Biosciences	555899	在脾细胞处理过程中裂解红细胞
70 µm 无菌细胞筛	Corning	352350	在脾细胞处理过程中滤除大块组织颗粒
100 mm 多聚-D-赖氨酸包被培养皿（BioCoat）	Corning	356469	促进 HEK293 细胞贴壁，以实现转染后最大程度的增殖
二甲基亚砜	Sigma Life Sciences	D2650	甲基咪唑并四嗪（temozolomide）完全溶解所必需
生理盐水	Hospira	IM 0132 (5/04)	甲基咪唑并四嗪和氯胺酮/赛拉嗪的溶剂
Ketathesia HCl	Henry Schein Animal Health	11695-0701-1	氯胺酮溶液
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	赛拉嗪无菌溶液，100 mg/mL