一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

摘要

来源：Riccione, K.，等。在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 脾切除与T细胞制备

第0天：

1. 将 10 ml T 细胞培养基（TCM）倒入 50 ml 锥形管中，并置于冰上，用于脾脏收集。
2. 按照美国兽医协会（AVMA）指南，通过 CO₂ 窒息法及二次断头法处死适量动物：将动物放入笼中，以每分钟 10–30% 笼体积的流速通入 CO₂（每次最多可同时处死 5 只动物），直至呼吸停止并持续两分钟。将动物从 CO₂ 室中取出并进行断头处理。
   注意：一只 6–12 周龄雌性 C57BL/6 小鼠的脾脏可获得约 4.5–5 × 10⁷ 个脾细胞。本实验中将采集 4 只小鼠的脾脏，以获得约 200 × 10⁶ 个细胞。
3. 将小鼠右侧朝上平放，并用 70% 乙醇喷洒消毒。用镊子夹住左侧肋骨下方的一小片皮肤，用剪刀剪开一个小切口。剥离皮肤后，小心用镊子夹起腹膜的一小片褶皱，剪开一个小口。
4. 脾脏为一细长、深红色、类似扁豆状的小器官；用镊子轻柔夹住脾脏，剪除周围结缔组织将其摘除。将摘除的脾脏放入盛有 10 ml TCM 并置于冰上的锥形管中。
5. 将脾脏组织置于 70 μm 细胞筛网上，用 5 ml 注射器内芯的钝端轻轻研磨，以制备单细胞悬液。每个筛网最多处理两个脾脏。
6. 在研磨完成后，用少量 TCM 小心冲洗筛网，以收集残留的脾细胞。将所有研磨后的脾脏细胞合并为单一的单细胞悬液。用 TCM 补充至终体积 50 ml，以 300 × g 离心 10 分钟进行一次洗涤。
7. 通过将 5 ml 10× 裂解缓冲液加入 45 ml 无菌水中，配制 1× 裂解缓冲液。为去除红细胞，将沉淀重悬于 50 ml 锥形管中，每只脾脏使用 5 ml 1× 裂解缓冲液，通过轻柔吹打充分混匀。若处理超过 5 只脾脏，应使用 250 ml 离心管。将锥形管或离心管置于 37 °C 水浴中 5 分钟。
8. 从水浴中取出裂解反应管，加入与裂解缓冲液体积比为 1:1 的 TCM 以中和反应。以 300 × g 离心 10 分钟进行洗涤。
9. 吸除上清液，用 TCM 将沉淀完全重悬（每只脾脏 2 ml，4 只脾脏共 8 ml），通过反复吹打混匀。
10. 取 10 μl 细胞悬液加入 190 μl 台盼蓝溶液（1:20 稀释），进行细胞计数。将计数板四个方格之一中所得细胞数乘以 20 × 10⁴ × 总体积（8 ml），得到总细胞数（例如，125 个细胞 × 20 × 10⁴ × 8 ml = 200 × 10⁶ 个脾细胞）。
11. 将细胞用 TCM 稀释至浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/ml，并补充 2 μg/ml 刀豆蛋白 A（ConA）和 50 IU/ml 重组人白细胞介素-2（rhIL-2）。因此，对于 200 × 10⁶ 个脾细胞，需向 8 ml 细胞中加入 92 ml 培养基、200 μg ConA 和 5,000 IU rhIL-2。
12. 将 2 ml 细胞悬液加入 24 孔组织培养板的每一孔中，使每孔含有 4 × 10⁶ 个细胞（例如，100 ml 细胞悬液约需 4 块板）。
13. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。

2. 转导

第1天：

1. 根据收获的脾脏数量乘以2，计算转导所需的未经组织培养处理的24孔板数量（4个脾脏需要8块板）。
2. 接着，通过（总孔数 + 3）× 0.5 ml 计算包被所需重组人纤连蛋白片段（RHFF）溶液的总体积（8块板 × 24孔 = 192 + 3 = 195）× 0.5 ml = 97.5 ml。
3. 通过将总体积乘以25 μg/ml，配制含25 μg/ml RHFF的97.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）（97.5 × 25 = 2437.5 μg）。将此量的RHFF加入97.5 ml PBS中。
4. 向每个孔中加入0.5 ml PBS/RHFF溶液，包被未经组织培养处理的24孔板。
5. 在4 °C下孵育过夜。

第2天：

6. 从未经组织培养处理的24孔板中弃去PBS/RHFF溶液。
7. 每孔加入1 ml含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，室温孵育30分钟。
8. 将孔板倒置以彻底去除BSA溶液，然后每孔加入2 ml PBS进行洗涤。
9. 收集病毒上清液：将每个涂有聚-D-赖氨酸（PDL）的人胚胎肾293T（HEK293T）细胞板中的培养基转移至250 ml离心管中，500 × g离心10分钟。
10. 小心地将病毒上清液转移至新的250 ml离心管中，注意不要扰动可能形成的细胞沉淀。
11. 向病毒上清液中加入新鲜TCM培养基，使最终体积比RHFF包被孔所需体积多3 ml。例如，对于192个RHFF包被孔，将病毒上清液体积补至192 + 3 ml = 195 ml。
12. 从培养箱中取出培养的脾细胞，通过轻柔吹打每孔2–3次使其重悬，转移至250 ml锥形管中。若使用多通道移液器，可在转移前使用无菌储液槽以加快操作速度。按前述方法计数后，在300 × g下离心10分钟。
13. 向病毒上清液中加入重组人白细胞介素-2（rhIL-2），终浓度为50 IU/ml。例如，向195 ml病毒上清液中加入50 × 195 = 9,750 IU rhIL-2。
14. 将脾细胞以1 × 10⁶ 个细胞/ml的密度重悬于病毒上清液中。
15. 每孔加入1 ml脾细胞悬液至RHFF包被的24孔板中。
16. 按照以下条件离心90分钟：770 × g，加速度 = 4，刹车/减速度 = 0，温度32 °C。
17. 配制含50 IU/ml rhIL-2的TCM培养基。例如，通过加入10,000 IU rhIL-2配制200 ml TCM。离心后每孔加入1 ml rhIL-2/TCM混合液。
18. 在37 °C、5% CO₂条件下培养过夜。

3. CAR T 细胞培养与收获

第3天和第4天：

1. 若T细胞融合度达到>80%，可进行细胞传代（通常发生在第3天或第4天）。传代时，轻轻吹打每孔细胞2-3次，将每孔中的1 ml细胞悬液转移至新的24孔组织培养板的新孔中。然后，向每孔加入1 ml含50 IU/ml IL-2的新鲜TCM，使每孔终体积为2 ml。
2. 若细胞未达到>80%融合度，则进行半量换液：缓慢从每孔上层吸出1 ml培养基，注意避免扰动沉降至底部的细胞。随后向每孔加入1 ml含50 IU/ml rhIL-2的新鲜TCM。

第5天：

3. 轻轻吹打每孔细胞3次，重悬CAR T细胞，并转移至250 ml离心管中。在300 × g下离心10分钟。
4. 彻底吸除上清液，避免扰动沉淀。用PBS洗涤一次，按前述方法计数细胞，再用PBS洗涤第二次。典型的CAR T细胞产量约为每孔1 × 10⁶个细胞（8块板 × 24孔 = 192 × 10⁶个CAR T细胞）。
5. 将细胞重悬于PBS中，浓度为5 × 10⁷/ml，用于注射体积为200 μg时含1 × 10⁷个细胞（例如，对于192 × 10⁶个CAR T细胞，将洗涤后的沉淀重悬于3.84 ml PBS中）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刀豆球蛋白 A	Sigma Aldrich	C2010	非特异性有丝分裂原，用于诱导 T 细胞增殖和病毒转导
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	T 细胞培养基
牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分—标准级	Gemini Bio Products	700-100P	阻断逆转录病毒与连环蛋白包被板之间的非特异性结合
Pharm Lyse（10 倍浓缩液）	BD Biosciences	555899	在脾细胞处理过程中裂解红细胞
70 µm 无菌细胞筛	Corning	352350	在脾细胞处理过程中滤除大块组织颗粒
100 mm 多聚-D-赖氨酸包被培养皿（BioCoat）	Corning	356469	促进 HEK293 细胞贴壁，以实现转染后最大程度的增殖
二甲基亚砜	Sigma Life Sciences	D2650	甲基咪唑并四嗪（temozolomide）完全溶解所必需
生理盐水	Hospira	IM 0132 (5/04)	甲基咪唑并四嗪和氯胺酮/赛拉嗪的溶剂
Ketathesia HCl	Henry Schein Animal Health	11695-0701-1	氯胺酮溶液
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	赛拉嗪无菌溶液，100 mg/mL