将效应T淋巴细胞递送至携带人脑肿瘤的小鼠体内

摘要

来源：Jarry, U.，等。在人源原位胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型中进行细胞毒性免疫细胞的立体定向过继转移。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种立体定向注射技术，用于将人效应T淋巴细胞注入携带人脑肿瘤的小鼠模型中。将荷瘤的麻醉小鼠固定于立体定向仪上，并在颅骨注射部位钻出小孔后，将效应T淋巴细胞注射至肿瘤部位。

方案

涉及样本采集的所有操作均按照本机构的IRB指南进行。涉及动物模型的所有操作均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 细胞毒性效应T淋巴细胞的非特异性扩增

1. 准备并以35 Gy照射饲养细胞。用于刺激2 x 10⁵ - 4 × 10⁵ 效应细胞，准备 10 x 10⁶ 外周血单个核细胞（PBMCs）和 1 x 10⁶ 来自三位不同健康供体的B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）。
2. 用含10%热灭活胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/mL）、链霉素（0.1 µg/mL）和300 IU/mL重组白细胞介素-2（IL-2）的15 mL Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）重悬饲养细胞和效应细胞。
3. 加入植物血凝素（PHA-L），终浓度为 1 µg/mL，轻轻混匀，然后将 150 µL 细胞悬液分装至 96 孔圆底培养板的每孔中。
4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 在湿润的环境中。
5. 每天观察培养板，直至培养孔中形成较大的细胞团块（约第7天）。
6. 将细胞以 1 x 10⁶ cells/mL 新鲜培养基中。
7. 通过计数（每周两次）确定总细胞数量，并将其维持在 1 x 10⁶ 细胞/mL 新鲜培养基中。
   注意： 效应免疫细胞应在静息状态下准备好用于治疗（通常在初次扩增刺激后约3周）。在使用前应检测这些效应细胞的纯度和反应性。 体内 注射（例如，其中 体外 检测方法。

2. 术前效应细胞的制备

1. 检查效应细胞数量后，通过离心（300 × g，5 分钟）将效应细胞收集至 50 mL 离心管中。
   注意：为弥补可能的细胞损失，需准备过量细胞（例如，50 × 10⁶）。
2. 小心弃去上清液，将细胞重悬于 15 mL 无菌 PBS 中，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟以完成洗涤。
3. 小心且彻底地移除上清液，然后将细胞沉淀重悬于 1 mL 无菌 PBS 中。
4. 将重悬的细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
5. 使用移液器缓慢地小心且彻底地移除上清液。
6. 按每只小鼠 8 µL 无菌 PBS 重悬细胞沉淀。
   注意：此步骤至关重要。
7. 使用微量移液器测量细胞悬液的体积。如有必要，加入无菌 PBS（每剂 20 × 10⁶ 个细胞溶于 15 µL PBS 中），并轻轻混匀。
8. 使用微量移液器确认每只小鼠的最终体积在 15 至 20 μL 之间（必须 < 20 µL）。
9. 将细胞置于冰上保存，直至进行立体定位注射。
   注意：未测试超过 3 小时的时间点。

3. 立体定位注射

1. 设备设置​
   1. 按照制造商的说明组装并校准小型动物立体定位仪，以确保颅内注射的准确性（例如注射器规格、所需体积和注射速率。
      注意： 建议采用缓慢的输注速率（即，2 - 3 µL/min。
   2. 在微生物安全柜（MSC）中安装材料，以保持器械的无菌状态，并防止小鼠感染。
      注意： 将“等温模块”置于37 °C水浴中，该系统可限制手术期间小鼠的低体温。在持续体温监测期间，必须使用术后护理所需的加热垫。
2. 术前动物准备
   1. ​通过腹腔注射氯胺酮（10 mg/mL）和赛拉嗪（0.1 mg/mL）对小鼠进行麻醉，剂量为每克体重10 µL。
   2. 进行脚趾捏压测试，以确认动物已完全麻醉并达到镇痛效果。
      注意： 任何运动都表明未达到深度镇痛状态，若出现此情况，需再等待数分钟，然后重复操作。
   3. 小鼠充分麻醉后，用剪刀剪去手术区域（从两耳之间至鼻部）的毛发。
3. 术前细胞制备
   1. 每次注射前，用移液器轻轻重悬细胞（数次），以防止细胞聚集。
   2. 用22号微量注射器小心吸取所需的细胞悬液体积（15 - 20 µL），避免吸入气泡。
      注意： 将细胞装入微量注射器的这一步骤对于尽量减少注射体积的差异至关重要。每次注射操作之间需重新装入细胞，以防止细胞聚集，并确保队列中效应细胞给药数量的均一性。
   3. 然后，将注射器放入适配的注射泵中。
4. 操作护理
   1. 用浸有5%聚维酮碘溶液的棉签对术区进行消毒，至少3次。
   2. 在小鼠眼部涂抹润滑性眼用软膏，以防止角膜干燥。
   3. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上，放置于覆盖无菌塑料膜的恒温加热板上，以维持小鼠术中体温并降低死亡率。
      注意： 小鼠的鼻部和牙齿应适当地置于门齿杆上方，以确保手术过程中呼吸通畅。
   4. 将小鼠置于门齿架上方后，拧紧小鼠耳下方的耳杆，以固定头部。
      注意： 注意不要损伤耳膜或影响呼吸。
   5. 使用无菌剪刀沿颅骨上部从前向后做一条1-2厘米长的正中矢状皮肤切口，以暴露颅骨。
   6. 确定矢状缝与冠状缝的交点（前囟，Bregma），作为注射前立体定位的解剖标志（如图所示） 图1).
   7. 将微量注射器置于该点上方。
   8. 将微量注射器移至前囟右侧2 mm、前0.5 mm处。
   9. 使用微型钻头在预定坐标处用无菌钻头在颅骨上钻一个小孔。操作时需保持浅层，以避免对脑组织造成创伤性损伤。
      注意： 在此方案中，免疫细胞被注射至已形成的肿瘤内（在肿瘤细胞注射后一周进行）。应重新切开皮肤（瘢痕处），并在先前用于肿瘤细胞移植的相同坐标位置进行注射（注射后两周内，原注射孔通常仍存在）。选择这些坐标是为了将肿瘤细胞和效应细胞注射至脑实质内。
5. 免疫效应细胞注射
   1. 小心将微量注射器插入钻孔中，缓慢推进，使针头在硬脑膜下深入3 mm，然后回撤0.5 mm，最终深度为2.5 mm，再注射效应细胞。
   2. 以2-3 µL/min的速度注射效应细胞，并在注射期间持续监测小鼠状态。
   3. 注射完成后，将针头回撤1 mm，微注射器保持原位1分钟，然后缓慢完全抽出微注射器，以防止灌注部位发生渗漏。
      注意： 动物从立体定位仪上移除后，立即清洁注射设备，以备后续实验使用。
6. 小鼠术后护理与随访​
   1. 将动物从立体定位仪上取下，立即在切口处涂抹5%聚维酮碘溶液，并用适当的外科缝线缝合皮肤。
   2. 在伤口处直接涂抹2%利多卡因凝胶，并通过皮下注射给予0.15 µg/g的丁丙诺啡，用于术后镇痛。
   3. 将麻醉后的小鼠放回笼中，置于设定为37 °C的加热垫上，以维持小鼠正常的体温，避免发生低体温。
      注意： 无需单独饲养。
   4. 监测小鼠直至其从麻醉中完全恢复，然后将其转移至饲养室。
      注意： 迄今为止，该方案已得到充分验证，因意外并发症极少发生（< 5%的注射小鼠）
   5. 每天监测小鼠，一旦观察到健康状况下降的迹象，立即实施安乐死例如、驼背姿势、活动能力下降、卧地不起或显著的体重减轻（≥ 15%）。

结果

图1：小鼠颅骨上主要解剖标志的示意图。包括用于确定注射位点方向的矢状缝（红线）和冠状缝（蓝线）及其交点（前囟）。图中已标示比例尺。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
外周血单个核细胞（PBMCs）			来自3名不同的健康供体
B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）			来自3名不同的供体
Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）	Gibco	31870-025
胎牛血清（FCS）	Dutscher	S1810-500
L-谷氨酰胺（L-glutamine）	Gibco	25030-024
青霉素/链霉素（penicillin/streptomycin）	Gibco	15140-122
白细胞介素-2（IL-2）	Novartis	proleukin
植物血凝素-L（PHA-L）	Sigma	L4144
立体定位仪	Stoelting Co.	51600
立体定位仪用小鼠适配器	Stoelting Co.	51624
微量注射泵	WPI	UMP3-4
NanoFil微量注射器	WPI	NF34BV-2
NSG小鼠	Charles River	NSGSSFE07S
氯胺酮（Ketamine）	Merial	Imalgène 1000
赛拉嗪（Xylazine）	Bayer	Rompur 2%
剪刀	WPI	201758
镊子	WPI	501215
OmniDrill 115/230V	WPI	503598
Vicryl 4-0	Ethicon	VCP397H
利多卡因（Xylocaine）	Astrazeneca	3634461