使用 CRISPR-Cas9 系统基因改造 CAR T 细胞

摘要

来源：Sterner, R. M. 等，利用 CRISPR/Cas9 敲除 CAR-T 细胞中的 GM-CSF ，《可视化学报》（2019）

该视频概述了通过CRISPR-Cas9系统制备基因修饰CAR T细胞的流程。将CRISPR和CAR慢病毒共同感染T细胞，可实现对目标基因的修饰，并合成嵌合抗原受体（CAR），最终生成基因修饰的CAR T细胞。

方案

1. CART19 细胞的制备

1. T细胞分离、刺激及体外培养
   1. 在细胞培养超净台中进行所有细胞培养操作，并使用适当的个人防护装备。从去标识化的正常供体在单采术期间收集的血锥中分离外周血单个核细胞（PBMCs），因为这些血锥已被证实是PBMCs的有效来源。
   2. 分离PBMC时，向50 mL密度梯度分离管中加入15 mL密度梯度介质。用等体积含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释供体血液，以避免细胞滞留。
      1. 将锥形容器中稀释后的供体血液加入分离管，注意不要扰动血液与密度梯度介质之间的界面。在1,200 x g 室温下孵育10分钟。
      2. 将上清液转移至新的50 mL离心管中，用PBS + 2% FBS定容至40 mL洗涤，300 x g离心 g 室温孵育8分钟，吸除上清液，加入40 mL缓冲液重悬细胞，计数细胞。
   3. 使用全自动细胞分离仪，根据制造商说明书，通过阴性选择磁珠试剂盒从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离T细胞。
   4. 为了培养分离的T细胞，制备T细胞培养基（TCM），其成分为10%人AB血清（v/v）、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液（v/v）和无血清造血细胞培养基。使用0.45 µm无菌真空滤器过滤培养基进行初步除菌，再用0.22 µm无菌真空滤器进行终滤除菌。
   5. 第0天（T细胞刺激当天），在刺激T细胞前对CD3/CD28磁珠进行洗涤。洗涤时，取所需体积的磁珠（CD3/CD28磁珠用量应达到磁珠：T细胞为3:1的比例）； 注意 磁珠的浓度可以有所变化）置于无菌的1.5 mL微量离心管中，加入1 mL TCM重悬。
   6. 置于磁铁接触处。
   7. 1分钟后，吸除TCM，加入1 mL新鲜TCM重悬以洗涤磁珠。
   8. 重复此步骤，共进行三次洗涤。
   9. 第三次洗涤后，将磁珠重悬于1 mL TCM中。
   10. 计数T细胞。
   11. 以3:1的微珠与细胞比例将微珠加入T细胞中。
   12. 将细胞稀释至终浓度为 1 x 10⁶ 细胞/mL
   13. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 24 小时。
2. T细胞转染与转导
   1. 使用增强型生物安全二级（BSL-2+）防护措施进行慢病毒操作，包括在细胞培养生物安全柜中操作、穿戴个人防护装备，以及在处理废弃材料前使用漂白剂进行消毒。
   2. 获取含有嵌合抗原受体-T19（CART19）的慢病毒载体构建体。
      注意： 此处使用的CART19构建体经过设计并随后合成 从头合成 使用商业化的蛋白质合成供应商。随后将CAR结构克隆至由EF-1α启动子调控的第三代慢病毒载体中。该单链可变区片段来源于FMC63克隆，可识别人CD19。CAR19结构包含第二代4-1BB共刺激结构域和CD3ζ刺激结构（FMC63-41BBz）。
   3. 按照先前所述方法进行慢病毒的制备。
      1. 简而言之，制备慢病毒时，使用贴壁生长至70-90%汇合度的293T细胞。
      2. 在加入293T细胞前，将转染试剂于室温孵育30分钟，转染试剂包括：15 µg目标慢病毒质粒、18 µg gag/pol/tat/rev包装载体、7 µg VSV-G包膜载体、111 µL预复合试剂、129 µL转染试剂以及9.0 mL转染培养基。随后将转染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养₂.
      3. 收获，在900 × g下离心10分钟，经0.45 µm尼龙滤器过滤，通过超速离心（13,028 × g）在24和48小时浓缩上清液 g 18 小时或 112,700 × g 2小时。
      4. 在 -80 °C 冻存以备将来使用。
   4. 第1天，轻轻重悬T细胞，以打散已被刺激形成的T细胞花环结构，细胞密度为1 × 10⁶/mL，第0天
   5. 在进行所有慢病毒操作时，应采取适当的BSL-2+级防护措施，将新鲜或冻存的收获病毒以3.0的感染复数（MOI）加入刺激后的T细胞中。
3. CAR T细胞扩增
   1. 在扩增阶段，继续将转导的T细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂在第3天和第5天计数CAR T细胞，并加入新鲜预温的TCM培养基，以维持CAR T细胞浓度为1 × 10⁶ cells/mL⁶/mL
   2. 刺激后第6天（第6天）使用磁铁从转导的T细胞中去除磁珠。将T细胞收集、重悬，并转移至50 mL锥形管中，置于磁铁上1分钟。随后收集上清液（含CAR T细胞），弃去磁珠。
   3. 将收集的CAR T细胞以1 x 10⁶个/mL的浓度重新放入培养液中培养⁶ 细胞/mL，以继续扩增。
   4. 第6天，通过流式细胞术检测CAR的表面表达。
      注意： 可采用多种方法检测CAR的表面表达，例如使用山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附的二抗进行染色，或使用与荧光染料偶联的CD19特异性肽段进行染色。取培养物中的等分试样（约100,000个T细胞），用流式缓冲液（含Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水、2%胎牛血清和1%叠氮化钠）洗涤一次。用抗CAR抗体对细胞染色后，洗涤两次。随后用活/死细胞染料和CD3单克隆抗体（OKT3）对细胞进行染色。再次洗涤细胞后，重悬于流式缓冲液中。通过流式细胞仪检测以确定转导效率。
4. CAR T细胞冻存
   1. 在刺激后第8天（T细胞扩增第8天）收获并冻存CAR T细胞，从培养物中收获细胞。
   2. 300 × g 离心 5 分钟 g.
   3. 用含10%二甲基亚砜和90%胎牛血清的冻存液重悬细胞，每管1 mL，每毫升含1000万个细胞。
   4. 使用冻存容器在-80 °C超低温冰箱中以-1 °C/min的降温速率进行冻存，48 h后转移至液氮中。
   5. 在用于体外或体内实验之前，将CAR T细胞在温热的TCM中解冻。
   6. 洗涤细胞以稀释并去除二甲基亚砜，然后重悬至浓度为 2 x 10⁶ 细胞/mL，于温暖的TCM中，37 °C、5% CO₂条件下静置过夜₂.

2. 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF ^k/o）CART19的制备

1. 为破坏GM-CSF，使用靶向人GM-CSF（CSF2）第3外显子的向导RNA（gRNA），该gRNA通过筛选先前报道对编码人细胞因子GM-CSF的CSF2基因具有高效率的gRNA获得。
   注意： 使用了一种商业合成的科研级Cas9第三代慢病毒载体，该载体包含此gRNA（位于U6启动子下）。该载体含有嘌呤霉素抗性基因。gRNA序列为GACCTGCCTACAGACCCGCC。
2. 为了生产慢病毒，使用汇合度达到70-90%的293T细胞。
3. 将15 µg 目的慢病毒质粒、18 µg gag/pol/tat/rev 包装载体、7 µg VSV-G 包膜载体、111 µL 预复合试剂、129 µL 转染试剂和9.0 mL 转染培养基于室温孵育30分钟。
4. 向293T细胞中加入转染试剂。在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下培养₂).
5. 收获，在900 × g下离心10分钟，经0.45 µm尼龙滤器过滤，然后在24和48小时通过超速离心（13,028 × g）浓缩上清液 g 18 小时或 112,700 × g 孵育2小时，然后在-80 °C冷冻，以备后续使用。
6. 第1天，轻轻重悬T细胞以打散玫瑰花结。
7. 在符合BSL-2+标准的实验室中，将冻存或新鲜收获的病毒加入已活化的T细胞中，以生成CAR T细胞。使用CAR19慢病毒和靶向GM-CSF的CRISPR慢病毒共同转导T细胞。CAR19慢病毒的感染复数（MOI）为3。由于无法对CRISPR慢病毒进行滴定，因此采用由15 μg质粒制备所产生的病毒颗粒转导10 × 10⁶个细胞。⁶ T细胞
8. 参见步骤1中讨论的T细胞刺激、扩增和冻存的其余步骤.
9. 对于携带嘌呤霉素抗性的lentiCRISPR编辑T细胞，在第3天和第5天以每1 mL培养基中加入1 µg嘌呤霉素的浓度处理细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD3 单克隆抗体 (OKT3)，PE，eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 单克隆抗体 (UCHT1)，APC，eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX 系统 B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	流式细胞仪
二甲基亚砜	Millipore Sigma	D2650-100ML
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器）	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep 磁力架	STEMCELL Technologies	18002
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒	STEMCELL Technologies	17951	阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液
胎牛血清	Millipore Sigma	F8067
FITC 小鼠抗人 CD107a	BD Pharmingen	555800
固定液（培养基 A）	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA 构建体：名称：CSF2	GenScript	N/A	定制订单
CRISPR 指导 RNA 1；物种：人，载体：
pLentiCRISPR v2；抗性：氨苄青霉素；拷贝数：
高；质粒制备：标准递送：4 μg（免费）
（免费）
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
人 AB 血清；男性供体；AB 型；美国	Corning	35-060-CI
IFN γ 单克隆抗体 (4S.B3)，APC-eFluor 780，eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 转染试剂	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，适用于 405 nm 激发	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	7851
莫能菌素溶液，1000X	BioLegend	420701
小鼠抗人 CD28 克隆 CD28.2	BD Pharmingen	559770
小鼠抗人 CD49d 克隆 9F10	BD Pharmingen	561892
小鼠抗人 MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty 冻存容器	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6，克隆 G5	ATCC	CRL-3273	急性淋巴细胞白血病细胞系
无核酸酶水	Promega	P119C
Olympus 真空过滤系统，500 mL，PES 膜，0.22 μm，无菌	Genesee Scientific	25-227
Olympus 真空过滤系统，500 mL，PES 膜，0.45 μm，无菌	Genesee Scientific	25-228
Opti-MEM I 减血清培养基（1X），液体	Gibco	31985-070
PE-CF594 小鼠抗人 IL-2	BD Horizon	562384
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X），液体	Gibco	10378-016
透化液（培养基 B）	Invitrogen	GAS002S100
PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒	Invitrogen	K182001
嘌呤霉素二盐酸盐	MP Biomedicals, Inc.	210055210
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704
大鼠抗人 GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	全自动细胞分离仪
SepMate-50（IVD）	STEMCELL Technologies	85450
叠氮化钠，5%（w/v）	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基	Lonza	04-418Q