使用 CRISPR-Cas9 系统对 CAR T 细胞进行基因修饰

摘要

来源:Sterner， R. M. et al.， 使用 CRISPR/Cas9 敲除 CAR-T 细胞中的 GM-CSF。J. Vis. Exp. （2019 年）

该视频概述了通过 CRISPR-Cas9 系统创建转基因 CAR T 细胞的过程。用 CRISPR 和 CAR 慢病毒感染 T 细胞会导致靶基因的修饰和嵌合抗原受体或 CAR 的合成，最终导致转基因 CAR T 细胞的形成。

方案

1. CART19 细胞生产

1. T 细胞分离、刺激和离体培养
   1. 使用适当的个人防护设备在细胞培养通风橱中进行所有细胞培养工作。从单采术期间收集的去识别化正常供体血锥中收获外周血单核细胞 （PBMC），因为已知这些是 PBMC 的活来源。
   2. 要分离 PBMC，向 50 mL 密度梯度分离管中加入 15 mL 密度梯度培养基。用等体积的含有 2% 胎牛血清 （FBS） 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释供体血液，以避免细胞捕获。
      1. 将锥体中稀释的供体血液加入分离管中，注意不要干扰血液与密度梯度介质之间的界面。在 RT 下以 1,200 x g 离心 10 分钟。
      2. 将上清液倒入新的 50 mL 锥形瓶中，用 PBS + 2% FBS 洗涤至 40 mL，在 RT 下以 300 x g 离心 8 分钟，吸出上清液，重悬于 40 mL 缓冲液中，并计数细胞。
   3. 根据制造商的方案，使用全自动细胞分离器，通过阴性选择磁珠试剂盒从 PBMC 中分离 T 细胞。
   4. 为了培养分离的 T 细胞，制备由 10% 人 AB 血清 （v/v）、1% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 （v/v） 和无血清造血细胞培养基组成的 T 细胞培养基 （TCM）。通过 0.45 μm 无菌真空过滤器过滤，然后使用 0.22 μm 无菌真空过滤器对培养基进行消毒。
   5. 在第 0 天（T 细胞刺激当天），在刺激 T 细胞之前洗涤 CD3/CD28 珠子。洗涤时，放置所需体积的珠子（使用足够的 CD3/CD28 珠子，比例为 3:1 的珠子:T 细胞;注意，珠子的浓度可以变化），并在 1 mL TCM 中重悬。
   6. 与磁铁接触。
   7. 1 分钟后，吸出 TCM 并重悬于 1 mL 新鲜 TCM 中以洗涤珠子。
   8. 重复此过程，总共洗涤 3 次。
   9. 第三次洗涤后，将珠子重悬于 1 mL TCM 中。
   10. 计数 T 细胞。
   11. 以 3:1 珠子:细胞的比例将珠子转移到 T 细胞中。
   12. 将细胞稀释至终浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
   13. 在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
2. T 细胞转染和转导
   1. 使用 BSL-2+ 预防措施进行慢病毒工作，包括细胞培养罩、个人防护设备以及在处置前用漂白剂对用过的材料进行消毒。
   2. 在慢病毒载体中获得嵌合抗原受体-T19 （CART19） 构建体。
      注意:此处使用的 CART19 构建体是设计并使用市售蛋白质合成供应商从头合成的。CAR 构建体随后在 EF-1α 启动子的控制下被克隆到第三代慢病毒中。单链可变区片段来源于 FMC63 克隆，可识别人 CD19。CAR19 构建体具有第二代 4-1BB 共刺激域和 CD3ζ 刺激 （FMC63-41BBz）。
   3. 如前所述进行慢病毒生产。
      1. 简而言之，要生产慢病毒，需要利用已达到 70-90% 汇合度的 293T 细胞。
      2. 在添加到 293T 细胞中之前，允许转染试剂在室温下孵育 30 分钟，包括 15 μg 目标慢病毒质粒、18 μg gag/pol/tat/rev 包装载体、7 μg VSV-G 包膜载体、111 μL 预复合物试剂、129 μL 转染试剂和 9.0 mL 转染培养基。然后在 37 °C、5% CO₂ 下培养转染的细胞。
      3. 收获，离心（900 x g 10 分钟），过滤（0.45 μM 尼龙过滤器），并在 24 和 48 小时通过以 13,028 x g 超速离心 18 小时或 112,700 x g 浓缩上清液 2 小时。
      4. 在 -80 °C 下冷冻以备将来使用。
   4. 第 1 天，轻轻重悬 T 细胞，以打破第 0 天以 1 x 10⁶/mL 刺激的 T 细胞玫瑰花结。
   5. 在所有慢病毒工作的适当 BSL-2 + 预防措施下，以感染复数 （MOI） 为 3.0 的速率将新鲜或冷冻收获的病毒添加到受刺激的 T 细胞中。
3. CAR T 细胞扩增
   1. 在扩增阶段，继续在 37 °C、5% CO₂ 下孵育转导的 T 细胞。在第 3 天和第 5 天对 CAR T 细胞进行计数，并向培养物中加入新鲜的预热中药，以维持 CAR T 细胞浓度为 1 x 10⁶/mL。
   2. 刺激后 6 天（第 6 天）使用磁铁从转导的 T 细胞中取出珠子。收获、重悬并将 T 细胞放入磁铁中的 50 mL 锥形管中 1 分钟。然后收集上清液（含有 CAR T 细胞），并丢弃珠子。
   3. 将收集的 CAR T 细胞以 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度放回培养物中，以恢复扩增。
   4. 第 6 天，通过流式细胞术评估 CAR 的表面表达。
      注意:可以使用多种方法检测 CAR 的表面表达，例如用山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗染色，或者用与荧光染料偶联的 CD19 特异性肽染色。在这里，从培养物中取出等分试样（约 100,000 个 T 细胞），并用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水、2% 胎牛血清和 1% 叠氮化钠制备的流式缓冲液洗涤。用抗 CAR 抗体对细胞进行染色并洗涤两次。用活/死染色剂和 CD3 单克隆抗体 （OKT3） 对细胞进行染色。洗涤细胞并重悬于流式缓冲液中。在细胞仪上采集以确定转导效率。
4. CAR T 细胞冻存
   1. 为了在刺激后 8 天（T 细胞扩增的第 8 天）收获和冷冻保存 CAR T 细胞，请从培养物中收获细胞。
   2. 以 300 x g 旋转 5 分钟。
   3. 在由 10% 二甲基亚砜和 90% 胎牛血清组成的冻存培养基中，以每瓶 1000 万个细胞/mL 的浓度重悬于冻存培养基中。
   4. 在冷冻容器中冷冻，在 -80 °C 冰箱中达到 -1 °C/min 的冷却速率，然后在 48 小时后转移到液氮中。
   5. 在用于体外或体内实验之前，在温热的中药中解冻 CAR T 细胞。
   6. 洗涤细胞以稀释并去除二甲基亚砜，然后在温热的 TCM 中重悬至 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。在 37 °C、5% CO₂ 下静置过夜。

2. 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF ^k/o） CART19 产生

1. 为了破坏 GM-CSF，利用靶向人 GM-CSF （CSF2） 外显子 3 的向导 RNA （gRNA），该外显子通过筛选 gRNA 选择，先前报道对编码人细胞因子 GM-CSF 的 CSF2 基因具有高效率><。 注意:使用含有该 gRNA（在 U6 启动子下）的商业合成研究级 Cas9 第三代慢病毒构建体。该构建体包含一个嘌呤霉素抗性基因。gRNA 的序列是 GACCTGCCTACAGACCCGCC。
2. 为了生产慢病毒，利用已达到 70-90% 汇合度的 293T 细胞。
3. 让 15 μg 目标慢病毒质粒、18 μg gag/pol/tat/rev 包装载体、7 μg VSV-G 包膜载体、111 μL 预复合物试剂、129 μL 转染试剂和 9.0 mL 转染培养基在室温下孵育 30 分钟。
4. 向 293T 细胞中加入转染试剂。在 37 °C、5% 二氧化碳 （CO₂） 下培养。
5. 收获，离心（900 x g 10 分钟），过滤（0.45 μM 尼龙过滤器），并在 24 和 48 小时通过超速离心 13,028 x g 18 小时或 112,700 x g 浓缩上清液 2 小时，并在 -80 °C 下冷冻以备将来使用。
6. 第 1 天，轻轻重悬 T 细胞以分解玫瑰花结。
7. 在 BSL-2+ 批准的实验室中，将冷冻或新鲜收获的病毒添加到受刺激的 T 细胞中以生成 CAR T 细胞。用靶向 CRISPR 慢病毒的 CAR19 慢病毒和 GM-CSF 转导 T 细胞。添加 MOI 为 3 的 CAR19 慢病毒。由于 CRISPR 慢病毒的滴定不可行，因此使用 15 ug 质粒制备产生的病毒颗粒转导 10 x 10⁶ T 细胞。
8. 请参阅步骤 1 中讨论的 T 细胞刺激、扩增和冷冻保存的其余步骤。
9. 对于携带嘌呤霉素耐药性的 lentiCRISPR 编辑的 T 细胞，在第 3 天和第 5 天用浓度为 1 μg 嘌呤霉素/1 mL 的盐酸嘌呤霉素处理细胞。

材料