一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

摘要

来源：Agarwal, S.，等。人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA 序列，产生精确切割。细胞随后通过非同源末端连接机制修复这些断裂，从而实现基因敲除。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 原代人T细胞中sgRNA的设计与基因敲除

1. 设计CRISPR sgRNA
   注意： 多个服务器和程序可辅助设计靶向特异性的单链引导RNA（sgRNA）。在本方案中，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）sgRNA使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no）以及布罗德研究所的gRNA设计门户（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）进行设计。
   1. 针对每个靶基因，设计6至10条sgRNA序列以靶向早期编码外显子序列。
      ​注意： sgRNA应具有较高的靶向效率和较低的脱靶效率。每种用于评估sgRNA效率的机器学习算法略有不同，因此建议比较多个sgRNA设计工具，并筛选出6至10条sgRNA用于后续实验。
2. 原代人T细胞中的基因敲除
   1. 从健康志愿者供体获取自体外周血单个核细胞（PBMC）。本方案的示意图时间线见图1A，具体描述如下。
   2. 使用市售的CD4和CD8选择试剂盒分离CD4....

结果

图1. 经编辑的CAR-T细胞扩增及其群体倍增次数。 (A) 初代人源CAR-T细胞中CRISPR编辑与制备的时间线. (B) 使用库尔特计数仪测量模拟处理和CRISPR编辑的CD19 CAR-T细胞在扩增过程中的群体倍增数（n=3名健康供体；KO=基因敲除）C) 使用库尔特计数器测量CAR-T细胞扩增过程中细胞大小（µm3）的结果（n=3名健康供体）。D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4D-Nucleofactor 核心单元	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X单元	Lonza	AAF-1002X
Cas9-电穿孔增强剂	IDT	1075915
CD4+ T细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15062
CD8+ T细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15063
Corning 0.45 微米真空滤器/瓶	Corning	430768
Corning T150 细胞培养瓶	Millipore Sigma	CLS430825
DNAeasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69504
Glutamax 添加剂	ThermoFisher	35050061
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 原代细胞 4D-Nucleofactor X 试剂盒 L	Lonza	V4XP-3024
青霉素-链霉素-谷氨酰胺	ThermoFisher	10378016
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214