一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

摘要

来源：Agarwal, S.，等。人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA 序列，产生精确切割。细胞随后通过非同源末端连接机制修复这些断裂，从而实现基因敲除。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 原代人T细胞中sgRNA的设计与基因敲除

1. 设计CRISPR sgRNA
   注意： 多个服务器和程序可辅助设计靶向特异性的单链引导RNA（sgRNA）。在本方案中，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）sgRNA使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no）以及布罗德研究所的gRNA设计门户（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）进行设计。
   1. 针对每个靶基因，设计6至10条sgRNA序列以靶向早期编码外显子序列。
      ​注意： sgRNA应具有较高的靶向效率和较低的脱靶效率。每种用于评估sgRNA效率的机器学习算法略有不同，因此建议比较多个sgRNA设计工具，并筛选出6至10条sgRNA用于后续实验。
2. 原代人T细胞中的基因敲除
   1. 从健康志愿者供体获取自体外周血单个核细胞（PBMC）。本方案的示意图时间线见图1A，具体描述如下。
   2. 使用市售的CD4和CD8选择试剂盒分离CD4+和CD8+ T细胞。
   3. 将CD4+和CD8+ T细胞按1:1比例混合，并在R10培养基中以3×10⁶个细胞/mL的密度过夜培养，R10培养基中补充5 ng/mL人白细胞介素-7（huIL-7）和5 ng/mL人白细胞介素-15（huIL-15）。推荐添加IL-7和IL-15，因为已知它们可促进中央记忆表型的形成，且经IL-7和IL-15扩增的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞相比经白细胞介素-2（IL-2）扩增的CAR-T细胞具有更优的抗肿瘤效果。
   4. 次日，计数T细胞，并将5–10×10⁶个细胞在300×g离心5分钟。弃去所有上清液，用低血清最低必需培养基洗涤细胞沉淀。根据制造商说明（材料表），将细胞沉淀重悬于100 µL核转染溶液中。
   5. 在洗涤细胞的同时，通过将10 µg Cas9核酸酶与5 µg sgRNA在室温（RT）孵育10分钟，制备CRISPR相关蛋白9（Cas9）与gRNA组成的核糖核蛋白（RNP）复合物。Cas9与sgRNA的摩尔比为1:2.4。建议设置一个对照组（模拟转染对照），其中包含Cas9和电穿孔增强剂，但不含sgRNA。
      注意： 可在本步骤中分别制备各个靶点的RNP复合物，并在核转染时合并加入细胞，从而实现多重基因编辑，具体操作见下一步。选择合适的试剂组装RNP复合物是获得高效基因敲除（KO）的关键。例如，不同供应商提供的Cas9核酸酶具有不同的脱靶效应，而化学修饰的gRNA可降低对T细胞的毒性，从而提高基因敲除效率。
   6. 将步骤1.2.4中重悬的细胞与步骤1.2.5中制备的RNP复合物混合，加入4.2 µL的4 µM电穿孔增强剂（一条单链DNA [ssDNA] 寡核苷酸，与人类基因组无同源性）。充分混匀后转移至电穿孔比色皿中。避免产生气泡，因其会降低电穿孔效率。
   7. 使用脉冲代码EH111进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至含5 ng/mL huIL-7和huIL-15的R10培养基中，在12孔板中以5×10⁶个细胞/mL的密度于30 °C培养48小时。48小时后，继续进行T细胞活化与扩增。

结果

图1. 经编辑的CAR-T细胞扩增及其群体倍增次数。 (A) 初代人源CAR-T细胞中CRISPR编辑与制备的时间线. (B) 使用库尔特计数仪测量模拟处理和CRISPR编辑的CD19 CAR-T细胞在扩增过程中的群体倍增数（n=3名健康供体；KO=基因敲除）C) 使用库尔特计数器测量CAR-T细胞扩增过程中细胞大小（µm3）的结果（n=3名健康供体）。D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4D-Nucleofactor 核心单元	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X单元	Lonza	AAF-1002X
Cas9-电穿孔增强剂	IDT	1075915
CD4+ T细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15062
CD8+ T细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15063
Corning 0.45 微米真空滤器/瓶	Corning	430768
Corning T150 细胞培养瓶	Millipore Sigma	CLS430825
DNAeasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69504
Glutamax 添加剂	ThermoFisher	35050061
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 原代细胞 4D-Nucleofactor X 试剂盒 L	Lonza	V4XP-3024
青霉素-链霉素-谷氨酰胺	ThermoFisher	10378016
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214