生成双人源化 BLT（骨髓、肝脏、胸腺）小鼠模型

摘要

来源:Daharsh， L. et al.， 一种双重人源化 BLT 小鼠模型，具有稳定的类人肠道微生物组和人类免疫系统。J. Vis. Exp. （2019 年）

该视频演示了生成具有功能性人类免疫系统和稳定移植的类人肠道微生物组的双重人源化骨 BLT（骨髓、肝脏和胸腺）小鼠的方法。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 小鼠的住房和维护

1. 购买 6-8 周龄的 NSG 小鼠 （NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ）。
在
2. SPF 条件下，使用空气交换、预过滤器和高效微粒空气 （HEPA） 过滤器 （0.22 μm） 将小鼠安置在温度、湿度和压力受控的房间中。
   1. 将小鼠安置并维持在机架系统中的高压灭菌的单个微隔离器笼中，该系统能够管理与预过滤器和 HEPA 过滤器 （0.22 μm） 的空气交换。
3. 在已用 70% 乙醇预处理的 II 类 A2 型生物安全通风橱中对小鼠执行所有程序和作。在动物房工作之前，请淋浴并换上干净的磨砂膏、Tyvek 防护服、靴套、发帽、口罩和手套。在外科手术过程中，在 Tyvek 防护服外面穿手术衣。
   注意:在手术前进行紫外线 （UV） 光去污也是首选。
   1. 如果可能，对所有仪器和试剂进行高压灭菌，然后在将它们转移到通风橱之前对其进行消毒。
   2. 在作过程中，从机架上取下动物单独通风的笼子，并在将它们转移到通风橱之前对其进行消毒。
4. 给小鼠喂食辐照饮食并提供高压灭菌水。提供辐照食品，并根据需要补充额外的辐照食品。每周或根据需要更换高压灭菌水。
   注意:也可以使用高压灭菌的酸化水。提供的辐照饮食在制造后的保质期为 6 个月。

2. 人源化骨髓、肝脏和胸腺 （BLT） 小鼠的生成

注意:胡-BLT 小鼠的产生已经在前面描述过。

1. 手术当天，以 12 cGy/g 体重的剂量给予小鼠全身照射。
2. 准备小鼠进行手术。
   1. 通过腹膜内 （IP） 注射麻醉，给每只受照射的小鼠工作浓度为 100 mg/kg 的氯胺酮和浓度为 12 mg/kg 的甲苯噻嗪的混合物，其范围为每只小鼠 130-170 μL。要制备 3 ml 氯胺酮和甲苯噻嗪混合物，将 0.27 mL 原液浓度为 100 mg/mL 的氯胺酮和 0.03 mL 浓度为 100 mg/mL 的甲苯噻嗪加入 2.7 mL 无菌盐水中，并充分混合。注射前用 70% 异丙醇对皮肤进行消毒。
   2. 通过皮下注射给每只受辐照的小鼠丁丙诺啡 1 mg/kg 体重 （半衰期 72 小时，SR-LAB） 以进行持久的疼痛管理。
   3. 通过 IP 注射给每只受照射的小鼠 100 μL （858 μg） 头孢唑啉，用于术前抗生素预防。
   4. 在后来用于暴露左肾的手术部位，使用电动理发器在小鼠的左侧和内侧周围剃掉小鼠的毛发。
   5. 通过踏板反射（用力捏住脚趾）验证适当的麻醉水平。
   6. 如果在手术过程中的任何时候需要额外麻醉，请给予 3-5% 的异氟醚气体。
   7. 在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。如有需要，请贴上耳标。
3. 进行手术，将肝脏和胸腺组织植入左肾包膜。
   从
   1. 手术部位的中心开始，以循环方式向外移动，对手术部位的皮肤进行碘擦洗。用 70% 异丙醇重复此过程，用碘重复第三次。
   2. 使用镊子，首先将一个人胎肝组织碎片加载到套管针中。然后使用镊子将一个人胎儿胸腺组织碎片加载到套管针中。然后使用镊子将另一个人胎儿肝组织碎片加载到套管针中。组织应切割成 1-1.6 mm³ 以适合套管针的内部尺寸。
   3. 用镊子提起皮肤，用剪刀纵向切一个小口。将鼠标左侧的切口延长至 1.5-2 厘米。
   4. 用镊子提起肌肉层，用剪刀纵向做一个小切口。根据需要延长切口以露出肾脏。
   5. 轻轻抓住肾脏周围的脂肪组织，露出肾脏。不要直接触摸肾实质。
   6. 使用手术刀在肾包膜的后端做一个 1-2 毫米的切口。
   7. 通过平行于肾脏长轴的切口缓慢插入预装套管针，并释放肾包膜和肾脏之间的组织。
   8. 小心地将肾脏和肠道恢复到正常位置。使用可吸收的 5/0 P-3 （P-13） 缝合线和 13 毫米 3/8 圆针闭合肌肉层，使用手术缝合钉闭合皮肤。
4. 手术后，将小鼠放入干净的高压灭菌微隔离器笼中进行恢复。
   1. 为了最大限度地减少术后恢复过程中的热量损失，将装有小鼠的笼子放在加热垫上，该加热垫连接到加热和循环水的水泵。
   2. 监测小鼠，直到它们恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
5. 手术完成后 6 小时内，通过尾静脉注射从人胎儿肝组织中分离的 CD34 + 造血干细胞。
   1. 用加热灯加热鼠标。用 70% 异丙醇对尾部进行消毒，然后将 1.5 至 5 × 10⁵ 个干细胞/200 μL 注射到尾静脉中。
   2. 停止注射出血，将小鼠放回微隔离器笼中，将微隔离器笼放回笼架上。
      注意:术后小鼠通常饲养在一起，在恢复期间和恢复后，每个微隔离器笼 5 只。然而，只有当小鼠都在同一天接受手术时，它们才会被饲养在一起。
6. 每天检查老鼠。仔细监测手术缝合器并根据需要更换它们。密切监测小鼠是否有任何感染或不适的迹象。手术后几天在微隔离器笼的地板上供应高压灭菌的食物。
7. 手术后 7-10 天取下手术钉。给予 3-5% 的异氟醚气体以麻醉小鼠。小心地去除订书钉，然后在该部位涂抹抗生素和止痛药膏。
8. 允许 9-12 周重建人类免疫细胞，然后从每只人源化小鼠的内侧大隐静脉收集外周血。
   1. 使用适当大小的塑料锥形约束装置约束有意识的小鼠，该约束装置在小鼠头部附近有一个开口用于呼吸，在小鼠后部附近有一个开口以隔离一条腿。先将小鼠放入约束锥头中，然后轻轻地将一条腿拉过腿部开口。
   2. 用 70% 异丙醇喷洒孤立腿的内侧，然后将抗生素和止痛药膏涂抹在同一部位。
      注意:软膏有助于在无需脱毛的情况下揭示静脉的位置，还有助于血滴的形成。
   3. 使用 25 号针头以 90° 角穿刺静脉，并使用乙二胺四乙酸 （EDTA） 涂层的采血管收集 50-100 μL 血液。用无菌纱布对该部位施加压力来止血。出血停止后，将小鼠放回笼子中。
      注意:收集的最大血容量通常为每周 50 μL 或每两周 100 μL。
   4. 使用收集的外周血，使用流式细胞术和 hCD45、mCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19 抗体来测试人免疫细胞重建水平。

3. 抗生素治疗

1. 在抗生素治疗之前，收集治疗前粪便样本。将小鼠移至新的高压灭菌微隔离器笼中。
2. 每天准备新鲜的广谱抗生素鸡尾酒。
   1. 为小鼠的每个微隔离器笼准备 250 mL 水，其中含有新鲜制备的甲硝唑 （1 g/L）、新霉素 （1 g/L）、万古霉素 （0.5 g/L） 和氨苄青霉素 （1 g/L）。
      注意:使用高压灭菌或无菌水作为补充抗生素的饮用水。
   2. 将 9.2 克葡萄糖加糖饮料混合物加入 250 毫升补充抗生素的水中。
      注意:使用葡萄糖加糖饮料混合物可以掩盖抗生素的苦味，并有助于防止小鼠脱水。
   3. 更换抗生素和葡萄糖加糖饮料混合物，补充水，每天将小鼠置于新的高压灭菌笼中。
      注意:小鼠是自噬的，每天更换笼子会阻止小鼠重新接种肠道细菌。
   4. 为了最大限度地植入类人肠道微生物组，提供 14 天的抗生素。在抗生素治疗期间，监测小鼠的体重减轻和脱水。预计在前 3-4 天内体重会减轻，之后在治疗期间会趋于稳定。如果发生脱水，通过腹膜内注射给小鼠生理盐水或林格斯溶液。
      注意:其他肠道微生物组人源化方案要求口服强饲抗生素。虽然可以有效地消耗小鼠肠道细菌，但我们发现在饮用水中添加抗生素的侵入性较小的方法对我们的人源化小鼠造成的压力较小，并导致更好的结果。

4. 供体样本和粪便移植

1. 准备人类供体粪便样本。
   1. 使用适当制备的粪便微生物群移植 （FMT） 材料来源，将粪便移植到人源化小鼠中。
   2. 解冻 FMT 制剂并在厌氧室中厌氧条件下分装。
   3. 如果需要，在此步骤中将等量的粪便样本混合在一起，以产生无偏差的"人类"样本。
   4. 将 FMT 材料的冻融保持在最低限度，如果不需要等分或混合样品，则只需在程序前立即解冻。
2. 人类粪便移植
   1. 完成 14 天的抗生素治疗后，将饮用水改为高压灭菌水，并将小鼠移至新的高压灭菌笼中。停止每天更换笼子，并实施每 1-2 周更换一次笼子的时间表。
   2. 在停用抗生素后 24 小时和 48 小时进行两次粪便移植。
   3. 抗生素处理后 24 小时，解冻所需量的 FMT 材料，并通过口服强饲法给每只小鼠 200 μL FMT 材料。在抗生素后 48 小时再次重复该过程。
   4. 将任何剩余或剩余的解冻的 FMT 材料涂抹在人源化小鼠的皮毛上或笼子床上。

材料