构建双人源化BLT（骨髓、肝、胸腺）小鼠模型

摘要

来源：Daharsh, L. 等，一种具有稳定人源化肠道微生物组与人类免疫系统的小鼠双人源化BLT模型 J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了构建双人源化骨BLT（骨髓、肝和胸腺）小鼠的方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠的饲养与维护

1. 购买6-8周龄的NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ）。
2. 将小鼠饲养在具有空气交换、预过滤器和高效微粒空气（HEPA）过滤器（0.22 μm）的SPF级环境中，环境温度、湿度和压力均需受控。
   1. 将小鼠饲养并维持在可高压灭菌的独立通气隔离笼中，笼架系统应具备通过预过滤器和HEPA过滤器（0.22 μm）管理空气交换的能力。
3. 所有小鼠操作均应在已用70%乙醇预处理的II级A2型生物安全柜中进行。进入动物房前需淋浴，并更换清洁的刷手服、Tyvek防护服、鞋套、头帽、口罩和手套。在进行手术操作时，应在Tyvek防护服外加穿手术 gown。         
   注意：操作前建议使用紫外线（UV）照射进行去污染。
   1. 尽可能对所有器械和试剂进行高压灭菌，转移至生物安全柜前还需进行消毒。
   2. 操作过程中，将动物的  individually ventilated cages 从笼架中取出，并在转移至生物安全柜前进行消毒。
4. 为小鼠提供辐照饲料并给予高压灭菌水。提供辐照食物，并根据需要补充额外的辐照食物。每周或根据需要更换高压灭菌水。   
   注意：也可使用高压灭菌酸化水。所提供的辐照饲料在生产后保质期为6个月。

2. 人源化骨髓、肝脏和胸腺（BLT）小鼠的制备

注意：人源化BLT小鼠的制备方法此前已有描述。

1. 手术当天，对小鼠进行全身照射，剂量为每克体重 12 cGy。
2. 准备小鼠进行手术。
   1. 通过腹腔（IP）注射，为每只经照射的小鼠注射工作浓度为 100 mg/kg 的氯胺酮和浓度为 12 mg/kg 的赛拉嗪混合物，注射体积根据体重在每只小鼠 130–170 μL 之间。配制 3 mL 氯胺酮和赛拉嗪混合液时，将 0.27 mL 浓度为 100 mg/mL 的氯胺酮原液和 0.03 mL 浓度为 100 mg/mL 的赛拉嗪原液加入 2.7 mL 无菌生理盐水中，充分混匀。 注射前用 70% 异丙醇对皮肤进行消毒。
   2. 通过皮下注射，为每只经照射的小鼠注射 1 mg/kg 体重的丁丙诺啡（半衰期 72 小时，SR-LAB），用于长效镇痛管理。
   3. 通过腹腔注射，为每只经照射的小鼠注射 100 μL（858 μg）头孢唑林，用于术前抗生素预防。
   4. 使用电动剃毛器剃除小鼠左侧外侧及内侧手术区域的毛发，以暴露左肾。
   5. 通过足底反射（用力捏脚趾）确认麻醉深度是否合适。
   6. 若手术过程中任何阶段需要追加麻醉，给予 3–5% 的异氟烷气体。
   7. 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。如需标记，可加装耳标。
3. 进行手术，将肝脏和胸腺组织植入左肾包膜下。
   1. 对手术部位皮肤进行消毒，先用碘伏以手术区域中心为起点向外作环形擦拭。随后用 70% 异丙醇重复一次，再用碘伏重复一次。
   2. 使用镊子，先将一块人胎儿肝脏组织碎片装入套管针中；再用镊子将一块人胎儿胸腺组织碎片装入套管针中；最后再用镊子装入另一块人胎儿肝脏组织碎片。组织应切割为 1–1.6 mm³ 大小，以适配套管针的内径。
   3. 用镊子提起皮肤，用剪刀纵向做一小切口，并将切口在小鼠左侧延长至 1.5–2 cm。
   4. 用镊子提起肌肉层，用剪刀纵向做一小切口，根据需要延长切口以暴露肾脏。
   5. 轻轻夹住肾脏周围的脂肪组织以暴露肾脏，避免直接接触肾实质。
   6. 使用手术刀在肾包膜的后端做 1–2 mm 的切口。
   7. 将已装载组织的套管针缓慢经切口平行于肾脏长轴插入，并将组织释放至肾包膜与肾脏之间。
   8. 小心将肾脏和肠管复位。使用可吸收的 5/0 P-3（P-13）缝线配合 13 mm 3/8 圆形针缝合肌肉层，使用皮肤缝合钉关闭皮肤。
4. 术后将小鼠放入洁净的高压灭菌微隔离笼中恢复。
   1. 为减少术后恢复期间的热量流失，将装有小鼠的笼子置于连接水循环泵的加热垫上，以加热水并维持温度。
   2. 持续监测小鼠，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。
5. 手术完成后 6 小时内，通过尾静脉注射从人胎儿肝脏组织中分离的 CD34+ 造血干细胞。
   1. 使用加热灯对小鼠进行预热。用 70% 异丙醇消毒尾部，然后向尾静脉注射 1.5 至 5 × 10⁵ 个干细胞/200 μL。
   2. 止住注射部位出血后，将小鼠放回微隔离笼，并将笼子放回笼架。       
      注意：术后小鼠通常每笼五只共同饲养于一个微隔离笼中，恢复期间及之后均如此。但仅当所有小鼠在同一天接受手术时方可同笼饲养。
6. 每日检查小鼠，仔细观察手术缝合钉情况并根据需要更换。密切监测小鼠是否有感染或不适迹象。术后数天内在微隔离笼底部提供高压灭菌饲料。
7. 术后 7–10 天拆除手术缝合钉。使用 3–5% 异氟烷气体麻醉小鼠。小心拆除缝合钉后，在伤口处涂抹抗生素和镇痛软膏。
8. 给予 9–12 周时间以实现人源免疫细胞的重建，随后从小鼠的内侧隐静脉采集外周血。
   1. 使用合适尺寸的塑料锥形固定器限制清醒小鼠的活动，固定器前端留有供小鼠呼吸的开口，后端留有单腿穿出孔。将小鼠头部朝前放入固定器，然后轻轻将一条腿从腿部开口拉出。
   2. 用 70% 异丙醇喷洒被固定腿的内侧，然后在同一部位涂抹抗生素和镇痛软膏。 
      注意：该软膏有助于显示静脉位置，无需脱毛，同时有助于血液滴的形成。
   3. 使用 25 号针头以 90° 角穿刺静脉，用乙二胺四乙酸（EDTA）包被的采血管采集 50–100 μL 血液。用无菌纱布按压穿刺部位止血。止血后将小鼠放回笼中。
      注意：通常每周最多采集 50 μL，或每两周最多采集 100 μL。
   4. 使用采集的外周血，通过流式细胞术检测人源免疫细胞重建水平，所用抗体包括 hCD45、mCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19。

3. 抗生素处理

1. 在抗生素处理前，采集处理前的粪便样本。将小鼠转移至新的经高压灭菌的独立通风笼具中。
2. 每天新鲜配制广谱抗生素混合液。
   1. 为每笼小鼠准备250 mL饮用水，其中含新配制的甲硝唑（1 g/L）、新霉素（1 g/L）、万古霉素（0.5 g/L）和氨苄青霉素（1 g/L）。
      注意： 抗生素添加用水应使用经高压灭菌或无菌处理的水。
   2. 在250 mL含抗生素的水中加入9.2 g葡萄糖调味饮料粉。 
      注意： 使用葡萄糖调味饮料粉可掩盖抗生素的苦味，有助于防止小鼠脱水。
   3. 每天更换添加了抗生素和葡萄糖调味饮料粉的饮水，并将小鼠转移至新的经高压灭菌的笼具中。 
      注意： 小鼠具有食粪行为，每日更换笼具可防止其通过粪便重新接种肠道细菌。
   4. 为实现类人肠道微生物组的最佳定植，持续给予抗生素14天。在抗生素处理期间，监测小鼠体重减轻和脱水情况。通常在前3–4天内出现体重下降，之后在整个处理期间趋于稳定。若发生脱水，应通过腹腔注射给予小鼠生理盐水或林格氏液。
      注意： 其他肠道微生物组人源化方案采用口服灌胃给予抗生素。尽管该方法在清除小鼠肠道细菌方面有效，但我们发现将抗生素加入饮水中这一侵入性更小的方法对人源化小鼠造成的应激更少，并可获得更优的实验结果。

4. 供体样本与粪便移植

1. 准备人类供体粪便样本。
   1. 使用经过适当制备的粪便微生物移植（FMT）材料，用于向人源化小鼠进行粪便移植。
   2. 在厌氧工作站中，于厌氧条件下解冻FMT制剂并分装。
   3. 如需要，可在该步骤中将等量的粪便样本混合，以制备无偏倚的“人类” 样本。
   4. 尽量减少FMT材料的反复冻融；若无需分装或混合样本，则仅在操作前立即解冻。
2. 人类粪便移植
   1. 完成14天抗生素处理后，将饮用水更换为高压灭菌水，并将小鼠转移至新的高压灭菌笼具中。停止每日更换笼具，改为每1-2周更换一次笼具。
   2. 在停止抗生素治疗后的24小时和48小时，分别进行两次粪便移植。
   3. 抗生素治疗后24小时，解冻所需量的FMT材料，并通过口服灌胃方式给予每只小鼠200 μL的FMT材料。在抗生素治疗后48小时重复一次该操作。
   4. 将任何剩余或未用完的解冻FMT材料涂抹于人源化小鼠的毛发或笼具垫料上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物喂养针头 18G	Cadence Science	9928B
Clidox-s 激活剂	Pharmacal Research Laboratories	95120F
Clidox-s 基础液	Pharmacal Research Laboratories	96125F
DGM 108 笼架	Techniplast
扁平棕色购物袋 3-5/8"D × 6"W × 11-1/16"L	格雷格纳	12R063
FMT 上消化道递送菌群制备	OpenBiome	FMP30
葡萄味酷爱饮料	卡夫食品公司
hCD19-PE/Cy5	Biolegend	302209
hCD3-PE	Biolegend	300408
hCD4-Alexa 700	Biolegend	300526
hCD45-FITC	Biolegend	304006
hCD8-APC/Cy7	Biolegend	301016
乳酸钠林格溶液	Boston BioProducts 公司	PY-906-500
mCD45-APC	Biolegend	103111
Microvette 100 K3E	Microvette	20.1278.100
新孢林急救抗生素/止痛软膏	Neosporin
NSG小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ）	杰克逊实验室	5557
PrecisionGlide 25 G 针头	BD	305127
RS200 X射线辐照仪	RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 微隔离笼具	Techniplast
无菌非织造纱布	Fisherbrand	22-028-558
Teklad 全球 16% 蛋白质辐照小鼠饲料	Teklad	2916