生成多价显示外膜囊泡疫苗

Abstract

来源:Feng， R. 等人。基于显示 SARS-CoV-2 受体结合域的外膜囊泡的"即插即用"纳米颗粒疫苗平台。J. Vis. Exp.（2022 年）。

该视频演示了一种生成多价显示外膜囊泡 （OMV） 疫苗的方法。转染哺乳动物细胞以表达和分泌与 SpyTag 和多聚组氨酸标签融合的病毒抗原。然后使用次氮基三乙酸镍 （Ni-NTA） 亲和柱纯化这些抗原。将纯化的抗原与表达表面结合的 SpyCatcher （SC） 蛋白的外膜囊泡混合。多种抗原通过其 SpyTag （ST） 共价附着在 SpyCatchers 上，产生显示抗原的 OMV，用作多价疫苗。

Protocol

1. 质粒构建

1. 根据先前发表的报告，将编码 SpyCatcher 序列（图 1）的 DNA 插入氨苄青霉素抗性 pThioHisA-溶细胞素 A （ClyA） 质粒（参见材料表）中，以构建质粒 pThioHisA ClyA-SC。
2. 将合成的 SpyTag-SARS-CoV-2 受体结合域 （RBD）-多聚组氨酸标签 （Histag） 融合基因（图 1）连接到 BamH I 和 EcoR I 位点之间的 pcDNA3.1 质粒（参见材料表）中，以构建质粒 pcDNA3.1 RBD-ST 根据先前发表的报告。

2. OMV-SC 准备

1. 按照以下步骤执行 ClyA-SC 转换。
   1. 将 5 μL pThioHisA ClyA-SC 质粒溶液 （50 ng/μL） 添加到 50 μL BL21 感受态菌株中，轻轻吹气，然后在冰上冷却 30 分钟。
   2. 将溶液在 42 °C 的水浴中放置 90 秒，然后立即将混合溶液置于冰上 3 分钟。
   3. 向细菌悬浮液中加入 500 μL Luria-Bertani （LB） 培养基，混合后，在 37 °C 下以 220 rpm 培养 1 小时。
   4. 将所有转化接种到含有氨苄青霉素（100 μg/mL，参见材料表）的 LB 琼脂平板上，并在 37 °C 下培养过夜><。 注意:在随后的实验中，氨苄青霉素在培养基中保持相同浓度。否则，这可能会导致细菌中质粒的丢失。
2. 对于 OMV-SC 生产，请执行以下步骤。
   1. 从板（步骤 2.1.4.）中分离出单个菌落至 20 mL LB（氨苄青霉素抗性）培养基中，并在 37 °C 下以 220 rpm 培养过夜。
   2. 将细菌溶液（从步骤2.2.1开始）接种到2 L培养基中，以220 rpm，37 °C培养5小时，直至对数生长期（OD₆₀₀nm在0.6至0.8之间）。
   3. 当细菌溶液在 600 nm 处的 OD 达到 0.6-0.8 时，加入异丙基 β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，参见材料表），使细菌溶液的最终浓度为 0.5 mM，然后在 25 °C 下以 220 rpm 培养过夜。
3. 进行 OMV-SC 纯化。
   1. 将细菌溶液在 4 °C 下以 7,000 x g 离心 30 分钟。
   2. 用 0.22 μm 膜过滤器过滤上清液，然后使用 100 kD 超滤膜或中空纤维柱进行浓缩（参见材料表）。
   3. 通过 0.22 μm 膜过滤器过滤浓缩物，然后使用超速离心机在 4 °C 下以 150,000 x g 离心 2 小时（参见材料表），并用移液管弃去上清液。
   4. 用 PBS 重悬沉淀并将其储存在 -80 °C。该溶液可在 −80 °C 下保持长期稳定性。

3. RBD-ST 准备

1. 按照以下步骤进行 RBD-ST 转染。
   1. 选择合适的真核表达系统（例如，HEK293F），并在恢复后在 37 °C 下以 130 rpm 的速度培养细胞过夜。
   2. 将 20 μL HEK293F 细胞溶液添加到自动细胞计数器中（参见材料表），记录细胞数量，将浓度调节至 1 x 106 个细胞/mL，然后在 37 °C 下以 130 rpm 的速度培养细胞 4 小时。
   3. 通过 0.22 μm 膜过滤器过滤 RBD-ST 质粒，并将 300 μg 质粒加入细胞培养基中（参见材料表），直至最终体积为 10 mL;摇动 10 秒。
   4. 在水浴中将聚乙烯亚胺（PEI，1 mg/mL，参见材料表）加热至 65 °C，将 0.7 mL PEI 与 9.3 mL 细胞培养基混合，并间歇摇动 10 s.
      注意:不要剧烈摇晃溶液。否则，产生的气泡可能会影响转染效率。
   5. 将质粒溶液加入 PEI 溶液中，间歇摇动混合物 10 秒，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
   6. 将混合物添加到 280 mL 细胞培养基中，并在 37 °C 下以 130 rpm 的速度培养 5 天。
2. 进行 RBD-ST 纯化。
   1. 将细胞在 25 °C 下以 6,000 x g 离心 20 分钟，并使用移液管收集上清液。
   2. 用 2 mL 的 Ni-NTA 琼脂糖填充色谱柱（参见材料表），并用 3x PBS 洗涤 3 次。
   3. 将咪唑（参见材料表）加入细胞上清液中，使终浓度为 20 mM，并将细胞上清液上样 2 倍。
   4. 加入 3 柱体积 （CV） 的含有 20 mM 咪唑的 PBS 进行洗涤，并收集洗涤馏分。
   5. 用 3 CV 含有低浓度至高浓度（例如，0.3 M、0.4 M、0.5 M）咪唑的 PBS 进行梯度洗脱;每种浓度洗脱 2 次。
   6. 使用 SDS-PAGE 鉴定不同浓度梯度中的 RBD-ST
   。

4. OMV-RBD 生物偶联和纯化

1. 通过二辛可宁酸测定 （BCA） 方法测定蛋白质浓度（参见材料表）。
   1. 将标准牛血清白蛋白 （BSA） 蛋白溶液从 2 mg/mL 稀释至 0.0625 mg/mL，将纯化的 OMV-SC 和 RBD-ST 稀释 10 倍，然后以 50:1 （v/v） 的比例混合 BCA 工作溶液 A 和 B（在检测试剂盒中提供）。
   2. 加入稀释的蛋白质溶液（25 μL/孔）并与 BCA 工作溶液（200 μL/孔）混合;在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 测量每个孔在 562 nm 处的吸光度 （OD），并根据标准曲线计算蛋白质浓度。
2. 按照以下步骤进行 OMV-SC 和 RBD-ST 的生物偶联。
   1. 在 PBS 中以 40:1 （w/w） 的比例混合 OMV-SC 和 RBD-ST。
   2. 垂直旋转，在 4 °C 下以 15 rpm 的速度将混合物混合过夜><。 注意:不同的抗原可能以不同的比例发生反应。可以根据抗原的特性尝试不同的反应比率。

Results

图 1:本研究中使用的质粒序列。

Materials