生成多价展示外膜囊泡疫苗

摘要

来源：Feng, R., 等. 一种基于展示 SARS-CoV-2 受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种制备可展示多种抗原的外膜囊泡（OMV）疫苗的方法。首先，转染哺乳动物细胞，使其表达并分泌与SpyTag及多聚组氨酸标签融合的病毒抗原。随后，利用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱纯化这些抗原。将纯化后的抗原与表面表达SpyCatcher（SC）蛋白的外膜囊泡混合。多个抗原通过其SpyTag（ST）与SpyCatcher发生共价结合，从而在OMV表面展示抗原，形成多价疫苗。

方案

1. 质粒构建

1. 将编码 SpyCatcher 序列的 DNA（参见图1）插入氨苄青霉素抗性的 pThioHisA-Cytolysin A（ClyA）质粒（见材料表）的 BamH I 和 Sal I 位点之间，参照先前发表的文献构建质粒 pThioHisA ClyA-SC。
2. 将合成的 SpyTag-SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）-多聚组氨酸标签（Histag）融合基因（参见图1）连接至 pcDNA3.1 质粒（见材料表）的 BamH I 和 EcoR I 位点之间，参照先前发表的文献构建质粒 pcDNA3.1 RBD-ST。

2. OMV-SC 的制备

1. 按照以下步骤进行ClyA-SC转化。
   1. 将5 µL pThioHisA ClyA-SC质粒溶液（50 ng/µL）加入50 µL BL21感受态菌中，轻轻吹打混匀，冰上静置30 min。
   2. 将混合液置于42 °C水浴中90 s，然后立即放回冰上冷却3 min。
   3. 向菌液中加入500 µL Luria-Bertani（LB）培养基，混匀后于37 °C、220 rpm条件下培养1 h。
   4. 将全部转化产物涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL，参见材料表）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
      注意：在后续实验中，培养基中的氨苄青霉素浓度应保持一致。否则可能导致细菌中质粒丢失。
2. 进行OMV-SC的制备，执行以下步骤。
   1. 从平板（步骤2.1.4）挑取单菌落接种至20 mL含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
   2. 将上述菌液（来自步骤2.2.1）接种至2 L培养基中，于37 °C、220 rpm条件下培养5 h，直至进入对数生长期（OD₆₀₀nm值在0.6至0.8之间）。
   3. 当菌液在600 nm处的OD值达到0.6–0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，参见材料表），使终浓度为0.5 mM，随后于25 °C、220 rpm条件下过夜培养。
3. 进行OMV-SC的纯化。
   1. 将菌液于4 °C、7,000 × g条件下离心30 min。
   2. 用0.22 µm膜过滤上清液，然后使用100 kD超滤膜或中空纤维柱（参见材料表）进行浓缩。
   3. 将浓缩液再次经0.22 µm膜过滤，随后在4 °C、150,000 × g条件下超速离心2 h（参见材料表），弃去上清液。
   4. 用PBS重悬沉淀物，并于−80 °C保存。该溶液在−80 °C下可长期稳定保存。

3. RBD-ST 蛋白的制备

1. 按照以下步骤进行 RBD-ST 转染。
   1. 选择合适的真核表达系统（例如 HEK293F），复苏后在 37 °C、130 rpm 条件下过夜培养细胞。
   2. 将 20 µL HEK293F 细胞溶液加入自动细胞计数仪（见材料表），记录细胞数量，调整浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL，然后在 37 °C、130 rpm 条件下培养 4 小时。
   3. 将 RBD-ST 质粒通过 0.22 µm 滤膜过滤，加入 300 µg 质粒至细胞培养基中（见材料表），直至终体积为 10 mL；振荡 10 秒。
   4. 将聚乙烯亚胺（PEI，1 mg/mL，见材料表）在水浴中加热至 65 °C，取 0.7 mL PEI 与 9.3 mL 细胞培养基混合，并间歇振荡 10 秒。
      注意：切勿剧烈振荡溶液，否则产生的气泡可能影响转染效率。
   5. 将质粒溶液加入 PEI 溶液中，间歇振荡混合液 10 秒，于 37 °C 孵育 15 分钟。
   6. 将上述混合液加入 280 mL 细胞培养基中，在 37 °C、130 rpm 条件下培养 5 天。
2. 进行 RBD-ST 纯化。
   1. 在 25 °C 下以 6,000 × g 离心细胞 20 分钟，用移液器收集上清液。
   2. 用 2 mL 镍-NTA 琼脂糖（见材料表）填充层析柱，并用 3 倍柱体积的 PBS 洗涤 3 次。
   3. 向细胞上清液中加入咪唑（见材料表），使其终浓度为 20 mM，并将上清液上样两次。
   4. 用含 20 mM 咪唑的 PBS 洗涤 3 个柱体积（CV），并收集洗涤组分。
   5. 用含咪唑浓度由低到高（例如 0.3 M、0.4 M、0.5 M）的 PBS 进行梯度洗脱，每个浓度洗脱两次，每次 3 个柱体积。
   6. 使用 SDS-PAGE 鉴定不同浓度梯度中的 RBD-ST。

4. OMV-RBD 生物偶联与纯化

1. 采用双辛可宁酸法（BCA 法）测定蛋白质浓度（参见材料表）。
   1. 将标准牛血清白蛋白（BSA）蛋白溶液从 2 mg/mL 连续稀释至 0.0625 mg/mL，将纯化的 OMV-SC 和 RBD-ST 样品稀释 10 倍，然后按体积比 50:1 混合 BCA 工作液 A 和 B（试剂盒中提供）。
   2. 向每孔中加入稀释后的蛋白溶液（25 µL/孔），再加入 BCA 工作液（200 µL/孔），充分混匀；在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 在 562 nm 处测定各孔的吸光度（OD 值），并根据标准曲线计算蛋白浓度。
2. 按照以下步骤对 OMV-SC 和 RBD-ST 进行生物偶联。
   1. 在 PBS 缓冲液中按 40:1（w/w）的质量比混合 OMV-SC 和 RBD-ST。
   2. 在 4 °C 条件下以 15 rpm 的转速垂直旋转混合物过夜。
      注意： 不同抗原可能需要不同的反应比例。可根据抗原的特性尝试不同的反应比例。

结果

图1：本研究中使用的质粒序列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠	Sangon Biotech	A610028
自动细胞计数仪	Countstar	BioTech
BCA 蛋白定量试剂盒	cwbio	cw0014s
电泳装置	Cavoy	Power BV
高速冷冻离心机	Bioridge	H2500R
His-Tag 小鼠单克隆抗体	Cell signaling technology	2366s
咪唑	Sangon Biotech	A600277
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	70691
OPM-293 细胞培养基	Opm biosciences	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST 质粒	Wuhan genecreat biological techenology
磷酸盐缓冲液	ZSGB-bio	ZLI-9061
线性聚乙烯亚胺	Polysciences	23966-1
预染蛋白 Marker	Thermo	26616
pThioHisA ClyA-SC 质粒	Wuhan genecreat biological techenology
Quixstand 台式系统（100 kD 中空纤维柱）	GE healthcare
SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x)	Beyotime	P0015
氯化钠	Sangon Biotech	A100241
悬浮仪	Life Technology	Hula Mixer
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042B
超速离心机	Beckman coulter	XPN-100
紫外分光光度计	Hitachi	U-3900
酵母提取物	Sangon Biotech	A610961