一种用于研究同种免疫诱导的血管排斥反应的小鼠主动脉移植模型

摘要

来源：Enns, W.，等。同种免疫介导的血管排斥及移植性动脉硬化的 小鼠模型。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了一种建立小鼠主动脉移植模型的方法，用于研究同种免疫介导的血管排斥反应。将麻醉后的供体小鼠置于仰卧位后，仔细分离肾下腹主动脉（IAA）及其周围结构。结扎分支血管，并在切除前夹闭IAA两端以阻断血流。随后，将供体IAA植入同种异体受体小鼠体内，并通过吻合术恢复血流，以研究同种免疫介导的血管排斥反应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

使用 Balb/cYJ（H2^d）作为供体小鼠，C57Bl/6（H2^b）作为受体小鼠，以检测同种异体反应。实验所用小鼠的年龄为 8 至 12 周，可选用雌性或雄性小鼠。同基因型对照组则采用 C57Bl/6 供体的主动脉节段移植至 C57Bl/6 受体小鼠体内。

1. 供体与受体准备

注意：供体和受体均需在手术前进行麻醉和准备，以尽量减少移植物的缺血时间。本方案使用注射用麻醉剂，以避免使用吸入麻醉所需设备对动物造成的阻碍。然而，如有需要，吸入麻醉也是一种合适的替代方法。从首次注射麻醉剂开始，整个手术过程约需90分钟完成。移植物的缺血时间少于30分钟。

1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg；10 mg/ml）和赛拉嗪（10 mg/kg；1 mg/ml）进行麻醉。小鼠将在10至15分钟内进入镇静状态。通过夹捏动物足垫的脂肪部分评估麻醉深度。根据需要追加初始剂量三分之一的麻醉混合物，直至动物不再出现回缩反射。每次给予麻醉混合物后需密切监测呼吸频率。在手术过程中，每15分钟用镊子夹捏腹前壁一次，以评估麻醉水平。小鼠应维持深度麻醉状态60至90分钟。
2. 使用眼用软膏润滑小鼠眼睛，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 从胸中部至耻骨区域的腹部腹侧尽可能贴近皮肤剃除毛发。操作时需特别小心，避免划伤皮肤。切勿使用脱毛膏，因其可能经皮肤吸收并引起炎症反应。
4. 将动物仰卧位放置于加热台或加热垫上方的毛巾上。
5. 先用2%氯己定对术区进行初步擦拭消毒。准备较大的操作区域以最大限度暴露手术视野。从手术区域中心开始，向外呈直线或环形擦拭。擦拭后的纱布应丢弃。重复此步骤至少5次以上。随后在同一区域使用酒精棉片擦拭。待酒精完全挥发后，用碘伏溶液处理已清洁的区域，并用无菌纱布覆盖并铺巾。

2. 端对端吻合术操作步骤

1. 供体手术
   1. 整个手术过程中保持无菌操作。使用前，用0.5%加速过氧化氢溶液清洁所有台面和手术台表面。所有手术器械、纱布、手术单和手术衣均需包裹后进行高压灭菌。通过在每个包装内放置蒸汽灭菌指示条验证器械的无菌状态。每次手术使用无菌外科手套，并在手术间更换丢弃。对于多次手术，每次使用之间需用热玻璃珠灭菌器对手术器械进行灭菌。
   2. 将供体小鼠仰卧位放置于洁净的薄型有机玻璃板上，板外包覆无菌手术单，并置于手术显微镜下（放大倍数8–30倍）。
   3. 确认已达到第1.1节所述的充分外科麻醉深度后，开始手术。
   4. 使用无菌剪刀，从耻骨至剑突做一条单一的下腹部正中纵向切口。
   5. 使用小型牵开器打开腹壁以暴露腹腔。
   6. 使用无菌棉签轻轻将肠管向动物左侧上方推移，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖。将生殖器官向下推移，暴露肾下腹主动脉和下腔静脉（IVC）。定期用生理盐水湿润暴露的组织。
   7. 使用5号医用镊子，从左肾动脉水平至分叉处，将腹主动脉与下腔静脉分离。使用10-0聚酰胺单丝缝线结扎靠近主动脉的小分支。
   8. 一旦供体腹主动脉与下腔静脉分离完成，用生理盐水充分润洗血管，用湿纱布覆盖暴露的腹腔，并将供体置于无菌区域备用。每15分钟检查一次供体状态（呼吸、心血管功能及麻醉深度）。开始对受体进行操作，按以下步骤（2.2.1至2.2.7）分离受体主动脉。
   9. 当受体主动脉已与下腔静脉分离并暂置后，将供体重新置于显微镜下。使用两个4 mm微型血管夹，在目标节段的近端和远端（相距约5 mm）交叉夹闭供体主动脉。
   10. 使用Vannas-Tubingen显微剪刀，横断一段小段腹主动脉移植物（长3至4 mm）。
   11. 使用连接注射器的25G 5/8针头，用肝素化（100 U/ml）生理盐水冲洗切除的主动脉。确保针尖不与血管壁接触。
   12. 将主动脉置于含肝素化（100 U/ml）生理盐水的冰上保存备用。在动物仍处于深麻醉状态下，松开微型血管夹，通过放血法处死供体。
   13. 应在切除后30分钟内植入供体血管。尽管可通过切取更长的主动脉段将一个供体血管用于多个受体，但缺血时间应控制在30分钟以内。
2. 受体手术
   1. 整个手术过程中保持无菌操作，方法同供体手术。
   2. 将受体小鼠仰卧位放置于薄型有机玻璃板上，板外包覆无菌手术单，并置于手术显微镜下（放大倍数8–30倍）。
   3. 确认麻醉充分后，当动物无退缩反射时开始手术。
   4. 使用无菌剪刀，从耻骨至剑突做一条单一的下腹部正中纵向切口。
   5. 使用小型牵开器打开腹壁以暴露腹腔。
   6. 使用无菌棉签轻轻将肠管向动物左侧上方推移，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖。将生殖器官向下推移，暴露肾下腹主动脉和下腔静脉（IVC）。定期用生理盐水湿润暴露的组织。
   7. 从左肾动脉水平至分叉处，将主动脉与下腔静脉分离。如有必要，使用10-0聚酰胺单丝缝线结扎靠近主动脉的小分支。
   8. 使用两个4 mm微型血管夹，在目标节段的近端和远端（相距约5 mm）交叉夹闭主动脉。
   9. 使用Vannas-Tubingen显微剪刀，做一个单一的横向主动脉切口，并切除一小段腹主动脉（不超过0.5 mm），以容纳供体主动脉移植物。
   10. 用肝素化（100 U/ml）生理盐水冲洗切除的主动脉。供体主动脉移植物的长度应适中，以连接受体被切断的主动脉两端。
   11. 将供体主动脉移植物置于原位，并将移植物末端与受体主动脉末端吻合，确保移植物的解剖方向与受体一致。
   12. 用5号医用镊子轻轻夹住血管外膜，并稍作外翻。用镊子将连接10-0聚酰胺单丝缝线的针穿过血管壁全层，以固定供体主动脉移植物至受体切除的血管端。确保未因误缝血管后壁而导致血管开口闭合。
   13. 进行连续缝合时，在移植物上下两端的9点钟位置放置固定缝线。从移植物上端3点钟位置开始，使用两条连续缝线吻合切除的两端，并将缝线固定于固定缝线上。
       1. 翻转移植物，继续缝合至血管背侧，与起始固定缝线汇合。打结时避免对血管施加过大压力。对下端吻合重复相同缝合操作。
          注：间断缝合的起始方式与连续缝合相同，区别在于在两个固定缝线之间使用三针独立缝合完成吻合。吻合时间通常为20分钟。
   14. 吻合完成后，先松开远端微型血管夹，使血液逆向流动，检查吻合口是否有渗漏。如有渗漏，立即加针封闭漏点。若无出血，再松开近端血管夹。
   15. 检查移植血管，确认移植物及受体血管近端和远端无血流阻塞。供体和受体血管中明显的搏动表明血流通畅。使用一对镊子，轻轻夹住固定缝线的一端，稍作外翻以检查血管后壁。
       注：吻合口两端的血管壁不应出现皱缩。松开血管夹后血流不良是血栓形成的征象。
   16. 使用棉签将肠管复位至腹腔内。
   17. 使用Castroviejo持针器和Graefe镊子，以5-0聚丙烯缝线连续缝合法关闭腹壁。皮肤层使用相同缝线行皮下连续缝合关闭。
   18. 移植完成后立即肌内注射Torbugesic（1 mg/kg）。
   19. 术后立即按顺序皮下注射Atipamezole（1 mg/kg）、ketoprofen（5 mg/kg）以及温热的乳酸林格液。
   20. 术后立即将小鼠置于加热笼内，使用水毯保温过夜（12小时）。在麻醉恢复期间，将动物单独放置于清洁、干燥、无障碍的区域。笼内垫以灭菌纸巾，并将水毯温度调节至约20至22 °C。在笼底自由提供干湿颗粒饲料。
       注：术后护理的关键组成部分是在麻醉和手术恢复期间观察动物并根据需要进行适当干预。监测强度应根据动物个体情况调整，在麻醉刚结束的即刻阶段可能需要比术后后期更密切的监测。
   21. 持续监测接受麻醉的动物，直至其完全恢复。动物必须能够自主维持胸卧位，且表现平静、无疼痛迹象，方可无人看护。
   22. 术后连续三天皮下注射Buprenorphine（0.1 mg/kg，每日两次）和ketoprofen（5 mg/kg，每日一次）。
   23. 在术后至少三天内持续监测心血管和呼吸功能、体温以及术后疼痛或不适情况。可能需要额外护理措施，如给予镇痛药及其他药物，以及肠外补液以减少脱水和电解质丢失。
   24. 通过观察后肢运动功能评估移植手术的成功与否。移植完全成功的表现为后肢和尾部血流畅通，动物恢复后应立即出现，且在术后第二天完全恢复，无后肢瘫痪。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	品系编号 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	品系编号 001026
盐酸氯胺酮注射液 USP 100 mg/mL	Ketalean	DIN 00612316
赛拉嗪注射液 20 mg/mL	Rompum	DIN 02169592
酮洛芬注射液 100 mg/mL	Anafen	DIN 01938126
酒石酸布托啡诺注射液 10 mg/mL	Torbugesic	DIN 008450000
丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
盐酸阿替美唑无菌注射液	Antisedan	DIN 02237744
肝素钠注射液，USP，1000 单位/mL	McKesson Distribution	DIN 02264315
天然泪眼用软膏	Alcon	DIN 02082519
体视显微镜	Leica	M80
0.9% 氯化钠，无菌	Baxter Corporation
乳酸林格液，无菌	Baxter Corporation
0.9% 氯化钠注射液，无菌，10 mL	Baxter Corporation
酒精消毒片	Loris
聚维酮碘	Betadine
4% w/v 葡萄糖酸氯己定	Germi-Stat
黑色聚酰胺单丝线	AROSurgical Instruments	T4A10Q07
缝合线，10-0 规格，70 微米	Corporation
蓝色单丝缝合线 5-0，P3 针	Ethicon	8698G
1 mL 注射器	BD	货号 309659
10 mL 注射器	BD	货号 309604
1cc TB 胰岛素注射器，带 28G 1/2 针头	BD	货号 309309
25G 7/8 皮下注射针头	BD	货号 305124
27G 1/2 皮下注射针头	BD	货号 305109
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