一种带血管异位脾脏移植的小鼠模型

摘要

来源：Wang, J., 等 用于研究脾细胞生物学与移植免疫的带血管异位脾移植小鼠模型。 J. Vis. Exp. (2019)。

该视频演示了一种建立血管化异位脾移植小鼠模型的外科手术方法。通过外科手术打开麻醉供体小鼠的腹腔以摘除脾脏。识别下腔静脉和肾下主动脉，结扎其腰支，在受体小鼠体内建立异位移植位点用于移植同系供体小鼠的脾脏。完成血管吻合并恢复移植脾脏的血流后，关闭切口并监测小鼠的恢复情况。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 外科准备、麻醉与镇痛方案

1. 将无菌一次性手术单（45.7 cm × 66 cm）铺在手术台上。轻轻抓取小鼠，腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，并皮下注射0.05 mg/kg丁丙诺啡以镇痛。
2. 通过夹捏脚趾法确认麻醉深度，用剃刀剃除整个腹部区域的毛发，并将小鼠置于手术显微镜下（6–10倍放大）的无菌手术台上。

2. 供体脾脏采集

1. 用酒精消毒片对腹部进行消毒，用手术胶带固定四肢，用剪刀从耻骨至剑突处做一条3-4 cm的正中垂直皮肤切口。
2. 使用回形针制成的无菌牵开器牵开腹壁，用无菌棉签将肠管移至腹部右侧（术者左侧）以暴露脾脏。使用无菌低温电凝器凝固附着于脾脏的胃短静脉（图1A）。将一块浸有37 °C生理盐水的无菌纱布覆盖在脾脏上以保持其湿润（图1B）。
3. 通过结扎门静脉的分支（胰十二指肠上静脉和胃右静脉），将门静脉从胰腺组织中分离并游离出来（图1C）；在远离脾静脉处的门静脉上放置缝线（图1D）。
4. 将脾脏翻转至右侧，以暴露腹主动脉、腹腔干及脾动脉（图1E）。通过结扎肝动脉和胃动脉，解剖并游离腹主动脉-腹腔干-脾动脉；在腹腔动脉近端的腹主动脉上放置缝线（图1F-G）。
5. 向下腔静脉（IVC）注射100国际单位（IU）肝素，以实现全身肝素化，并等待3分钟确保肝素起效。结扎腹腔动脉近端的腹主动脉，横断门静脉，然后从腹腔干远端的腹主动脉以10 mL肝素化冷生理盐水（4 °C）进行全身灌注（10 mL/20 s）（图1H）。
6. 将脾脏移植物连同相关的腹主动脉-腹腔干-脾动脉段、门静脉、一段脾静脉以及少量胰腺组织整块切取。移植前将移植物保存于5 mL、4 °C的生理盐水中。通过颈椎脱臼法处死小鼠。

3. 受体脾切除术与脾脏移植物植入

1. 将加热垫放置在手术平台上，并将温度调节至 37 °C。在加热垫上覆盖一张无菌手术巾（45.7 cm × 66 cm），以构建无菌手术区域。重复步骤 2.1 和 2.2 进行手术准备和麻醉处理。按步骤 2.1 和 2.2 所述方法，做一条 3–4 cm 的腹正中切口，并牵开腹壁。
2. 使用无菌棉签将小鼠肠道轻轻移至右侧，以暴露受体脾脏。结扎脾静脉和脾动脉，随后切除脾脏。
3. 将小鼠肠道小心移至左侧，并用浸有无菌 37 °C 生理盐水的湿纱布覆盖肠道。解剖并结扎肾下主动脉和下腔静脉（IVC）的腰支；使用两个 4 mm 的微血管夹对肾下主动脉和下腔静脉进行交叉夹闭。
4. 将一根 11-0 尼龙缝线穿过肾下主动脉（全层），并牵拉固定，随后用显微剪刀做一次完整剪切，形成椭圆形主动脉切口（长度应与供体主动脉直径相匹配，图 2A）。使用 30 G 针头穿刺下腔静脉，形成椭圆形静脉切口，并用显微剪刀将开口延长至与供体门静脉长度相匹配（图 2A）。
5. 使用 500 μL 肝素化生理盐水（10 单位/mL）冲洗主动脉和下腔静脉管腔内的血液或血凝块。
6. 将脾脏移植物置于受体小鼠腹部右侧；仔细辨认供体主动脉袖口和供体门静脉。确认血管无扭曲后，用浸有冷（4 °C）生理盐水的纱布覆盖脾脏移植物。
7. 使用两根固定缝线（11-0 尼龙缝线，以下相同）将供体主动脉袖口连接至受体主动脉切口的近端和远端顶点（图 2B,C）。在供体主动脉袖口与受体主动脉切口之间（前壁）采用 2–3 针连续 11-0 尼龙缝线完成吻合（图 2D）。将脾脏移植物翻转至受体左侧；在供体主动脉袖口与受体主动脉切口之间（后壁）完成吻合（图 2E）。
8. 采用 4 至 5 针连续缝线，从下腔静脉内侧开始，将供体门静脉与受体下腔静脉后壁吻合，随后在下腔静脉外侧打结闭合（图 2F,G）。
9. 松开血管夹，并使用无菌棉签压迫止血，直至脾脏颜色恢复（图 2H）。
10. 使用 5-0 合成可吸收缝线（Vicryl）以连续方式缝合腹壁。使用 5-0 尼龙缝线以间断方式缝合皮肤层。
    注意： 对于步骤 3.7–3.8，可选择另一种操作顺序：先将供体门静脉与受体下腔静脉后壁吻合（步骤 3.8）；然后在主动脉内侧使用 2–3 针连续缝线，将供体主动脉袖口与受体主动脉切口后壁吻合，并在主动脉外侧打结闭合。

4. 动物恢复

1. 关闭腹腔后，通过4个不同的位置（每个位置0.25 mL）皮下注射1 mL温生理盐水。
2. 术后最初几小时内，将小鼠置于温度控制的培养箱（30 °C）中，监测小鼠直至其意识充分恢复，然后将其转移至新的洁净笼中，笼内提供常规食物和水，并在笼子下方放置加热垫（30 °C）。术后将小鼠单独饲养在独立的笼中。

5. 术后疼痛管理

1. 术后24小时和48小时，皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡以维持镇痛方案。

结果

图1：供体脾脏切取。（A）电凝与脾脏相连的胃短静脉。（B）将一小块无菌温湿纱布覆盖于脾脏表面以保持其湿润。（C）解剖并分离胰腺后方的门静脉。（D）结扎门静脉的侧支，并在脾静脉远端的门静脉周围放置缝线。虚线表示后续横断的位置，用于与受体下腔静脉进行吻合。（E）将脾脏翻转至腹腔右侧（术者左侧），以暴露腹腔干及其分支（包括脾动脉）和主动脉。（F）通过结扎另外两个分支，解剖并游离腹主动脉—腹腔干—脾动脉。（G）在腹腔动脉近端的主动脉周围放...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Wyeth	206205-01
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	139-236
肝素溶液	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
注射级生理盐水	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% 乙醇	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare 小动物重症监护系统	Thermocare, Inc.
艾德森镊	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
德鲁夫持针器	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
超精细显微解剖剪	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
微型夹	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 丝线	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 尼龙线，带 4 mm (3/8) 针	Sharpoint DR4	AK-2119
小鼠 CD45.2 抗体	BD Bioscience	553772
小鼠 CD45.1 抗体	BD Bioscience	553776
小鼠 CD11b 抗体	BD Bioscience	557657
小鼠 B220 抗体	BD Bioscience	553089
小鼠 Ly6C 抗体	eBioscience	48-5932-80
小鼠 Ly6G 抗体	BD Bioscience	561236
小鼠 F4/80 抗体	BD Bioscience	565614
小鼠 CD11c 抗体	BD Bioscience	558079
小鼠 CD3 抗体	eBioscience	48-0032-82
小鼠 CD4 抗体	BD Bioscience	552051
小鼠 CD8 抗体	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ 可固定紫红色死细胞染色试剂盒	Thermo Fisher	L34955