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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 丹麦株卡介苗（BCG）定量甘油菌种的制备 结核分枝杆菌 H37Rv
注意： 所述所有实验方案均在生物安全等级3级（BSL3）条件下进行。
- 解冻BCG Danish或H37Rv菌株的甘油冻存菌种，取100 μl接种于10 ml含0.05%（v/v）Tween-80和10%（v/v）ADC（白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）的7H9培养基中。
- 在37 °C静置培养一周，直至菌液进入对数生长期。
- 将10 ml培养物转接至200 ml新鲜培养基中扩大培养，在静置条件下继续培养20天。
- 将菌液转移至50 ml离心管中，以2500 × g离心15分钟。
- 弃去上清液，用残留液体重悬菌体沉淀，每管加入无菌的3 mm直径玻璃珠（每管10–15颗）。
- 剧烈涡旋震荡1分钟以充分分散细菌团块，将每管沉淀重悬于10 ml含0.05%（v/v）Tween-80的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 静置10分钟，使较大的细菌聚集体和玻璃珠充分沉降。
- 从4个离心管中各取9.5 ml上清液（含较小菌团和单个细菌），合并至一个新的50 ml离心管中（最终回收体积为38 ml），以400 × g离心10分钟。
- 将35 ml上清液（主要含单个细菌）转移至一个新的50 ml离心管中，加入15 ml含50%（v/v）甘油的PBS，使终浓度为15%（v/v）甘油。
- 轻柔混匀后，分装为每管1 ml的等份，置于适宜的冻存管中，于-80 °C保存（每批可获得约50份甘油菌种）。
- 为定量甘油菌种，于冻存次日取出解冻，并在分别装有900 μl PBS的1.5 ml离心管中进行七次十倍系列稀释。
- 取每种稀释液100 μl，接种于含10%（v/v）ADC、在55 mm培养皿中制备的7H10固体琼脂平板上。
- 小心加入3 mm直径玻璃珠（每板约10颗），轻轻摇晃平板使液体均匀分布，随后弃去玻璃珠，并用封口膜密封琼脂平板。
- 在37 °C培养21天，通过计数可清晰分辨单菌落的稀释度中的菌落形成单位（CFU）来确定细菌浓度。
2. 小鼠疫苗接种
- 解冻一份预先定量的 BCG 甘油菌种，并用 PBS 稀释，制备两种菌悬液。根据每只动物皮下接种剂量为 100 μl（皮下免疫剂量为 107 CFU/ml）和鼻内接种剂量为 40 μl（鼻内免疫剂量为 2.5 × 107 CFU）计算最终体积。
- 使用适用于啮齿类动物的专用麻醉工作站，以异氟烷与氧气的混合气体麻醉小鼠。使用 5% 异氟烷诱导麻醉，2% 异氟烷维持麻醉状态（也可使用其他被认可的麻醉方法）。
- 进行皮下疫苗接种时，用 1-ml 注射器配 26 G 针头吸取 1 ml 细菌悬液（107 CFU/ml），并排除气泡。
- 将麻醉后的小鼠置于超净台内的平坦表面上，呈俯卧位，于小鼠背部一侧皮下接种 100 μl 疫苗（106 CFU/剂）。接种后将小鼠放回笼中，并密切观察，确保其从麻醉中正常恢复。
- 每次接种小鼠之间需更换注射器针头，并按上述方法排除气泡。
- 进行鼻内接种时，将麻醉后的小鼠置于超净台内，呈仰卧位。
- 使用微量移液器吸取 20 μl 含 2.5 × 107 CFU/ml 的菌悬液，将接种液逐滴滴入两鼻孔之间，直至全部体积滴完，每滴之间留出时间让小鼠吸入。
注意：小鼠在该操作过程中可能出现呼吸困难，因此应在每滴接种后让其充分吸收后再给予下一滴，以尽可能避免此类情况。
- 再次用微量移液器吸取 20 μl 菌悬液并重复上述操作。若小鼠在第一次接种后开始苏醒，应在第二次接种前将其放回麻醉舱中。接种完成后将小鼠放回笼中，并确保其从麻醉中完全恢复。
3. 采用 H37Rv 菌株进行小鼠经鼻感染
- 解冻一份预先定量的 H37Rv 甘油菌种，并用 PBS 稀释，制备成每毫升含 2,500 CFU 的细菌悬液。根据每只动物接种剂量为 40 μl，计算所需的最终体积。
- 按 2.5 - 2.7 节所述方法，经鼻内接种 H37Rv。每只小鼠的最终攻毒剂量为 102 CFU/40 µl。