小鼠模型中通过鼻内免疫接种卡介苗

摘要

来源：Uranga, S. 等，小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效果及肺部免疫应答 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在小鼠中进行的鼻内BCG免疫接种，可激活先天性和适应性免疫反应，促进肺组织驻留记忆T细胞和效应B细胞的形成，从而增强对分枝杆菌（Mycobacterium）感染的防护作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 丹麦株卡介苗（BCG）定量甘油菌种的制备 结核分枝杆菌 H37Rv

注意： 所述所有实验方案均在生物安全等级3级（BSL3）条件下进行。

1. 解冻BCG Danish或H37Rv菌株的甘油冻存菌种，取100 μl接种于10 ml含0.05%（v/v）Tween-80和10%（v/v）ADC（白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）的7H9培养基中。
2. 在37 °C静置培养一周，直至菌液进入对数生长期。
3. 将10 ml培养物转接至200 ml新鲜培养基中扩大培养，在静置条件下继续培养20天。
4. 将菌液转移至50 ml离心管中，以2500 × g离心15分钟。
5. 弃去上清液，用残留液体重悬菌体沉淀，每管加入无菌的3 mm直径玻璃珠（每管10–15颗）。
6. 剧烈涡旋震荡1分钟以充分分散细菌团块，将每管沉淀重悬于10 ml含0.05%（v/v）Tween-80的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
7. 静置10分钟，使较大的细菌聚集体和玻璃珠充分沉降。
8. 从4个离心管中各取9.5 ml上清液（含较小菌团和单个细菌），合并至一个新的50 ml离心管中（最终回收体积为38 ml），以400 × g离心10分钟。
9. 将35 ml上清液（主要含单个细菌）转移至一个新的50 ml离心管中，加入15 ml含50%（v/v）甘油的PBS，使终浓度为15%（v/v）甘油。
10. 轻柔混匀后，分装为每管1 ml的等份，置于适宜的冻存管中，于-80 °C保存（每批可获得约50份甘油菌种）。
11. 为定量甘油菌种，于冻存次日取出解冻，并在分别装有900 μl PBS的1.5 ml离心管中进行七次十倍系列稀释。
12. 取每种稀释液100 μl，接种于含10%（v/v）ADC、在55 mm培养皿中制备的7H10固体琼脂平板上。
13. 小心加入3 mm直径玻璃珠（每板约10颗），轻轻摇晃平板使液体均匀分布，随后弃去玻璃珠，并用封口膜密封琼脂平板。
14. 在37 °C培养21天，通过计数可清晰分辨单菌落的稀释度中的菌落形成单位（CFU）来确定细菌浓度。

2. 小鼠疫苗接种

1. 解冻一份预先定量的 BCG 甘油菌种，并用 PBS 稀释，制备两种菌悬液。根据每只动物皮下接种剂量为 100 μl（皮下免疫剂量为 10⁷ CFU/ml）和鼻内接种剂量为 40 μl（鼻内免疫剂量为 2.5 × 10⁷ CFU）计算最终体积。
2. 使用适用于啮齿类动物的专用麻醉工作站，以异氟烷与氧气的混合气体麻醉小鼠。使用 5% 异氟烷诱导麻醉，2% 异氟烷维持麻醉状态（也可使用其他被认可的麻醉方法）。
3. 进行皮下疫苗接种时，用 1-ml 注射器配 26 G 针头吸取 1 ml 细菌悬液（10⁷ CFU/ml），并排除气泡。
4. 将麻醉后的小鼠置于超净台内的平坦表面上，呈俯卧位，于小鼠背部一侧皮下接种 100 μl 疫苗（10⁶ CFU/剂）。接种后将小鼠放回笼中，并密切观察，确保其从麻醉中正常恢复。
5. 每次接种小鼠之间需更换注射器针头，并按上述方法排除气泡。
6. 进行鼻内接种时，将麻醉后的小鼠置于超净台内，呈仰卧位。
7. 使用微量移液器吸取 20 μl 含 2.5 × 10⁷ CFU/ml 的菌悬液，将接种液逐滴滴入两鼻孔之间，直至全部体积滴完，每滴之间留出时间让小鼠吸入。
   注意：小鼠在该操作过程中可能出现呼吸困难，因此应在每滴接种后让其充分吸收后再给予下一滴，以尽可能避免此类情况。
8. 再次用微量移液器吸取 20 μl 菌悬液并重复上述操作。若小鼠在第一次接种后开始苏醒，应在第二次接种前将其放回麻醉舱中。接种完成后将小鼠放回笼中，并确保其从麻醉中完全恢复。

3. 采用 H37Rv 菌株进行小鼠经鼻感染

1. 解冻一份预先定量的 H37Rv 甘油菌种，并用 PBS 稀释，制备成每毫升含 2,500 CFU 的细菌悬液。根据每只动物接种剂量为 40 μl，计算所需的最终体积。
2. 按 2.5 - 2.7 节所述方法，经鼻内接种 H37Rv。每只小鼠的最终攻毒剂量为 10² CFU/40 µl。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Middlebrook 7H9 肉汤	BD	271310
Middlebrook ADC 增补剂	BD	211887
Tween 80	Scharlau	TW00800250
直径 3 mm 玻璃珠	Scharlau	038-138003
Middlebrook 7H10 琼脂	BD	262710
1 ml 注射器，26G 0.45×10 mm	BD	301358
C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237
M 管	Miltenyi Biotec	130-093-236
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 × 30 mm，23G × 1 1/4"	UNIMED	27.134	用作支气管肺泡灌洗的气管插管
牛血清白蛋白	Sigma	A4503