在大鼠模型中诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘

摘要

来源：Üçal, M. 等，通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了一种建立广泛性大脑皮层脱髓鞘大鼠模型的方法。该方法包括通过向预先注射重组髓鞘蛋白的小鼠体内注射促炎性细胞因子，以破坏血脑屏障，从而促进免疫细胞浸润，导致广泛性大脑皮层脱髓鞘。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料准备

注意：手术需在无菌条件下进行。开始前，确保所有手术器械（包括钻头）均已使用适当的消毒剂清洁。

1. 配制麻醉混合液：每毫升含芬太尼 0.02 mg、咪达唑仑 0.4 mg 和美托咪啶 0.2 mg（混合液中的终浓度）。
   注意：有关替代麻醉剂的信息，请参见相应的讨论部分。
2. 配制解毒混合液：每毫升含氟马西尼 0.07 mg 和阿替美唑 0.42 mg（混合液中的终浓度）。
3. 将导管与带入口和螺钉的导管帽组装在一起。使用手术刀将导管切割至 2 mm 长度（图 1）。
   注意：请勿使用剪刀进行切割，因为剪刀会挤压并破坏导管尖端的圆形横截面形状。

2. 手术准备

1. 通过腹腔注射麻醉混合物（每公斤体重1.5 mL）对大鼠进行麻醉。
2. 使用电动剃须刀剃除大鼠两耳之间的头部毛发。在将动物放置于立体定位仪之前，先在立体定位仪上放置恒温毯，以避免手术过程中发生低体温。
3. 使用耳杆和门齿固定器将大鼠头部固定在立体定位仪上，确保头部水平且稳定。用手指或镊子对颅骨施加压力，检查其稳定性。
   注意：在立体定位仪中固定不牢或头部未保持水平可能导致实际操作坐标偏离预定位置。
4. 滴加润滑性眼药水，以防止手术期间角膜干燥。用不透光材料覆盖双眼，避免手术光源照射。
5. 通过交替使用70%乙醇和10%聚维酮碘溶液清洁已剃毛的区域。
   注意：手术期间应遵循所有预防措施以避免感染。手术需在无菌条件下进行。若无菌状态被破坏，则被污染的材料必须更换。

3. 导管植入

1. 在头部皮肤正中做一条长约 2 cm 的纵向切口。使用动脉夹将皮肤向两侧固定。有关这些步骤的概览，请参见 图 2。
2. 使用棉签清除血液。
3. 去除颅骨骨膜。用棉签清洁组织，暴露颅骨表面。让颅骨干燥约 1 分钟。
4. 确定解剖学标志点：人字缝（Lambda）、前囟（Bregma）和正中矢状缝。将钻头安装在立体定位仪上，将钻头尖端置于前囟作为起始点。从前囟向后移动 2 mm，再向正中矢状缝方向横向移动约 2.4 mm。
5. 在此位置钻出一个直径为 0.5 mm 的孔，用于插入导管。轻轻吹去骨屑。
   注意：钻孔过程中必须保持硬脑膜完整。为确保这一点，请做到：1）使用可安装在立体定位仪上的钻头；2）在钻孔过程中频繁检查钻孔情况；3）分步小幅度钻进。若对颅骨施加压力过大，当钻头穿透颅骨时会继续深入并损伤脑组织。
6. 在距离第一个孔几毫米处再钻三个用于固定螺钉的孔（直径约 1.3 mm）。轻轻吹除骨屑。
   注意：选择固定螺钉的位置时，应确保为导管顶部（直径约 2 mm）和固定螺钉顶部（直径约 1 mm）留出足够空间。
7. 使用注射器以约 1 - 2 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水冲洗清除骨屑。清洁颅骨表面。将固定螺钉拧紧 2 - 3 圈。
   注意：固定螺钉对于稳定装置至关重要，其作用是固定牙科水泥，从而固定导管位置。在拧紧固定螺钉时，需用镊子轻轻向上提拉检查，确保其不易松动。由于导管植入本身会造成组织创伤，若在钻孔或拧紧固定螺钉过程中额外造成硬脑膜损伤，将导致多重创伤性损伤，可能影响组内结果的可比性。因此应先拧紧固定螺钉，最后再插入导管。
8. 将长度为 2 mm 的导管垂直插入第一个孔，使其垂直于颅骨表面。在手持固定导管的同时，涂抹少量牙科水泥，并用牙科固化灯短暂照射（约 5 秒），使水泥初步聚合，以固定导管，便于下一步操作时可腾出双手。
   警告：使用牙科固化灯时，避免直视灯头或从操作区域反射的强光，因其高强度可能造成视网膜损伤。应佩戴适当的防护护目镜。
9. 在导管周围及固定螺钉处继续涂抹牙科水泥，并用牙科固化灯照射（约 15 - 30 秒）使其完全固化。使用镊子尖端检查水泥是否已完全硬化。

4. 伤口闭合与麻醉拮抗

1. 使用可吸收缝线在导管前后位置缝合头部皮肤。
   注意：由于植入完成后颅骨部位将形成不平整的结构，因此应相应地进行伤口缝合。过度牵拉皮肤会导致动物不适。
2. 使用1 mL注射器配合26 G针头，皮下注射解毒剂混合物（1.5 mL/kg体重）。
3. 皮下注射恩诺沙星（2.5%），剂量为7.5 mg/kg体重，用于预防性抗生素治疗；皮下注射卡洛芬（1 mg/mL，5 mg/kg体重）和丁丙诺啡（1.2 mg/kg），用于镇痛。

5. 术后护理与用药

1. 将动物放回改造后的笼子，并在术后1-3小时内持续观察，同时使用红外线照射以防止低体温。在整个恢复期间，每隔5到10分钟观察并重新调整动物体位一次。特别注意避免光线持续照射眼睛，直至动物完全恢复。
2. 术后次日，通过皮下注射重复给予恩诺沙星（7.5 mg/kg体重）和卡洛芬（1 mg/mL；5 mg/kg体重）。由于此前给予的布托啡诺药效可持续72小时，无需再次追加。

6. 免疫混合物的制备（导管植入后最早14天）

注意：在准备过程中将注射器置于冰上。

1. 将两个10 mL鲁尔锁扣尖端玻璃注射器连接到三通旋塞的短臂上，并用长臂关闭第三个出口。
2. 确保连接牢固且无泄漏：在握住活塞2的同时，向开口的注射器中加入约4 mL无菌PBS。插入活塞1，并来回推动两个活塞，同时检查是否泄漏。若无泄漏，弃去PBS，并再次取出活塞1。
3. 用移液器吸取1 mL不完全弗氏佐剂（IFA）和50 µg重组少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（rMOG_1-125），在合适的试管中用无菌PBS（pH 7.4）将混合物调节至终体积2 mL。
   注意：由于在制备过程中乳剂可能在注射器尖端或管壁上损失，因此应制备比实际注射所需更大的体积。同样，一次性为多只动物准备也更为实用。
4. 将稀释后的IFA与rMOG_1-125混合物装入开口的注射器中。在轻轻插入活塞的同时，对另一侧的活塞保持轻微压力（图3A）。
5. 通过来回推动活塞，将接种物从一个注射器推至另一个注射器，进行乳化，直至乳剂呈白色且黏稠（图3B）。
6. 将一个1 mL鲁尔锁扣注射器连接到三通旋塞的开口短臂上，并用接种物充满该注射器（图3C）。将所有接种物分装至1 mL注射器中，置于冰上直至注射。应在制备当天完成注射。

7. 免疫接种

1. 将大鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉（约 2 分钟，与氧气 2 L/min 混合），随后通过面罩维持麻醉（与氧气 1.5 L/min 混合）。
2. 使用 21 G 针头在尾根部皮下注射 200 µL 接种物。
   注意：由于溶液黏稠，应缓慢注射。

8. 脑内细胞因子注射

1. 调整连接套管的长度（2 mm）。（连接套管的制备步骤见图4。）
2. 用1 mL注射器吸取细胞因子混合液（含500 ng/µL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和300 U/µL重组大鼠干扰素-γ（IFN-γ）的无菌PBS溶液）。将注射器连接至连接套管，用细胞因子混合液充满套管，避免产生气泡。
3. 将注射器安装至可编程注射泵，并设定注射速率为0.2 µL/min（图5A）。启动泵并持续运行，以防止套管尖端形成气泡。
   注意：注射速度必须考虑所用注射器的内径；因此，在设置泵时需登记注射器的直径。
4. 将大鼠置于异氟烷麻醉舱中进行诱导麻醉（约2分钟，与2 L/min氧气混合），随后通过面罩维持麻醉（与1.5 L/min氧气混合）（图5B和图5C）。由于动物将至少麻醉30分钟，需使用润滑性眼药水保护角膜。
5. 取下带入口的导管帽，将连接套管插入导管中并旋紧（图5D和图5E）。
   注意：切勿过度拧紧，以免损坏导管顶端。
6. 持续注射10分钟（总注射体积为2 µL）。停止泵注。将套管保留在导管内20分钟，以确保注射液体充分扩散。
7. 逆时针旋转并缓慢拔出连接套管，避免产生负压效应。
8. 重新安装带入口的导管帽并旋紧。将动物置于笼中，使其从麻醉中恢复。

结果

图 1：导管的制备。（A 和 B）将导向套管与假性套管（带入口的导管帽）组装并旋紧。（C）然后用手术刀将导管切割至 2 mm 长度。显微观察显示，使用剪刀会导致套管尖端的圆形形状发生变形，因此必须避免使用剪刀。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年雄性Dark Agouti大鼠（300 ±25 g）
芬太尼	Hameln pharma plus, 德国		以枸橼酸芬太尼形式，50 µg/ml
咪达唑仑	ERWO Pharma, 奥地利	50039017	5 mg/ml
美托咪定	Orion Pharma, 芬兰		以盐酸美托咪定形式，1 mg/ml
氟马西尼	Roche, 瑞士		0.1 mg/ml
阿替美唑	Orion Pharma, 芬兰		以盐酸阿替美唑形式，5 mg/ml
10%聚维酮碘复合物	Mundipharma, 奥地利
牙科水泥	Heraeus Kulzer, 德国	6603 7633
生理盐水溶液	Fresenius Kabi, 奥地利		0.9% NaCl
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich, 德国	P3813
异氟烷	AbbVie, 奥地利
润滑性眼药水	Thea Pharma, 奥地利
70% EtOH	Merck, 德国	1070172511	将无水乙醇用ddH2O稀释配制为70% v/v
2.5%恩诺沙星	Bayer, 德国		预防性抗生素
卡洛芬	Pfizer, 美国		止痛药，50 mg/ml
吐温-20	Sigma-Aldrich, 德国	P9416
戊巴比妥	Richter Pharma, 奥地利		戊巴比妥钠，400 mg/ml
干扰素γ	PeproTech, 美国	400-20
肿瘤坏死因子α	R&D Systems, 美国	510-RT-050/CF
rMOG1-125	瑞典卡罗林斯卡研究所分子医学中心自产		重组大鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，N端氨基酸1-125，亦可商业购买：AnaSpec, AS-55152-500, 美国
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich, 德国	F5506
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, 德国	A9576
过氧化物酶底物溶液	Vector Laboratories, 美国	SK-45000
立体定位仪	David Kopf Instruments, 美国
导管，适用于MRI	PlasticsOne, 美国	8IC315GPKXXC
假性套管	PlasticsOne, 美国	8IC315DCNSPC
塑料螺钉，适用于MRI	PlasticsOne, 美国	8L080X093N01
连接套管	PlasticsOne, 美国	8IC313CXSPCC
螺丝刀，2 mm尖端尺寸
带柔性轴延长装置的钻机	Proxxon, 德国	NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,
钻头，圆形，0.5 mm	Hager & Meisinger, 德国	REF310 104 001 001 009
钻头，螺旋形，1.3 mm	Hager & Meisinger, 德国	REF350 104 417 364 013
手术刀片	Braun, 德国	BB510
手术刀柄	Fine Science Tools, 德国	91003-12
棉签	Henry Schein Medical, 奥地利	900-3155
手术剪	Fine Science Tools, 德国	14101-14, 14088-10
手术镊	Fine Science Tools, 德国	11002-12, 11251-35
动脉夹	Fine Science Tools, 德国	18050-35
恒温毯	TSE systems, 德国
红外灯	Beurer, 德国	616.51
牙科光固化灯	桂林啄木鸟医疗，中国
可吸收缝线	Johnson & Johnson, 比利时	V792E
可编程注射泵	World Precision Instruments, 美国	AL-1000
检查手套
手术服
电动剃须刀	Aesculap, 德国	GT420
挥发性麻醉剂蒸发器	Rothacher Medical, 瑞士	CV 30-301-D
挥发性麻醉剂蒸发器用氧气源	Air Liquide, 奥地利	19,113
挥发性麻醉室	Rothacher Medical, 瑞士	PS-0347
大鼠用麻醉面罩	Rothacher Medical, 瑞士	PS-0307-A
1 ml 注射器	Codan, 丹麦	REF 62.1612
26G 注射针头	Braun, 德国	4657683
20G 针头，用于细胞因子注射和免疫	Braun, 德国	4657519
鲁尔锁接头玻璃注射器	Poulten & Graf, 德国	7.140-37
三通阀	Becton Dickinson, 瑞典	394600
37°C 培养箱	Kendro, 德国	50042301
微量移液器	Gilson, 美国	F167350