构建感染细菌病原体的绵羊离体创伤皮肤模型

摘要

来源：Regan, H. C., 等 一种新型高通量 离体 用于测试新型抗生素的绵羊皮肤伤口模型 视频实验杂志 (2022).

该视频展示了生成一个 离体 感染绵羊皮肤模型 金黄色葡萄球菌这包括用抗生素处理羔羊前额皮肤活检样本，建立创面床，将其置于多孔板中带有无抗生素培养基的可渗透膜上，并在皮肤创面中建立细菌感染。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 灭菌

1. 在采集头部样本前，使用洁净的镊子并在200 °C干热灭菌烘箱中灭菌1小时，对镊子进行消毒。所有玻璃器皿在使用前于121 °C高压蒸汽灭菌15分钟。
2. 所有操作均应在二级微生物操作柜内进行。所有试剂的配制均应按照制造商说明书进行。

2. 样本采集

1. 在屠宰场，使用电击或高压气动枪使斯瓦尔代羊羔晕厥后放血致死。屠宰后不超过4小时收集羊羔头部。

3. 头部的制备

1. 将约 100 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液倒在样品区域，对羔羊前额部位进行消毒。使用电动剪毛器剃除头部前额区域的毛发，并用 200 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液清洗该区域。
2. 用乙醇和蓝色吸水纸擦拭该区域，然后涂抹脱毛膏覆盖样品区域，静置 35 分钟。使用刮刀轻轻刮去脱毛膏，并评估样品区域。若仍有大量毛发残留，请重复脱毛过程。
3. 再使用 200 mL 二氧化氯溶液冲洗该区域，随后用乙醇冲洗，并用蓝色吸水纸擦拭。
4. 使用无菌的 8 mm 活检打孔器，从准备好的区域切取 8 mm 的皮肤样本。使用无菌镊子和 15 号手术刀片取出样本，并确保彻底去除所有皮下脂肪组织。
5. 将样本放入装有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌 0.5 L 广口瓶中，随后转移至含有 50 mL 200 ppm 二氧化氯溶液的无菌 50 mL 离心管中，轻轻颠倒混匀两次，静置灭菌 30 分钟。
6. 从二氧化氯溶液中取出样本，将其置于装有 40 mL 无菌 PBS 的 50 mL 离心管中进行清洗。清洗后，将每块皮肤样本分别放入 24 孔板的独立孔中。
7. 加入 350 µL 预热的培养基，同时保持样本处于气液界面状态。培养基的成分为：MK 培养基（含 Hanks 盐、L-谷氨酸和 1.75 mg/mL 碳酸氢钠的 Medium 199）与 Ham's F12 培养基按 1:1 比例混合，并添加胎牛血清（FBS，10% v/v）、表皮生长因子（EGF，10 ng/mL）、胰岛素（5 µg/mL）、青霉素-链霉素（100 U/mL）和两性霉素 B（2.5 µg/mL）。
8. 使用透气性板封膜密封 24 孔板，并在 37 °C、5% CO₂ 的加湿组织培养箱中孵育，最长不超过 24 小时。

4. 皮肤样本的保存

1. 孵育后，移除培养基，并用 500 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样品。向每个样品中加入不含抗生素的培养基，在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润组织培养箱中孵育 24 小时，以去除样品中残留的抗生素。
2. 若在不含抗生素的培养基中孵育 24 小时后出现浑浊或真菌感染，则弃去该样品。

5. 接种物的制备

1. 准备一个50 mL离心管，加入10 mL无菌胰蛋白胨大豆肉汤。取一新鲜的金黄色葡萄球菌（S. aureus）琼脂平板，用拭子将多个菌落转移至肉汤中。在37 °C、150 rpm条件下培养18小时。
2. 以4,000 × g 离心3分钟。弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于10 mL无菌PBS中。重复此步骤两次，以确保细胞充分洗涤。
3. 用无菌PBS将接种物调整至OD₆₀₀为0.6。通过手动活菌平板计数法确认接种量。

6. 皮肤样本的感染

1. 用无菌镊子将24孔板的插入物放入含有400 µL预热无抗生素培养基的新鲜24孔板中。
2. 移除皮肤样本中的培养基，用500 µL无菌PBS洗涤，并吸去洗涤液。使用无菌镊子将样本轻轻固定在孔底。
3. 使用4 mm穿孔活检针在中央制造伤口瓣膜，穿刺深度约为1-2 mm。然后，使用15号刀片手术刀和无菌齿状Allis组织镊去除伤口瓣膜的表层组织。伤口尺寸的差异可能会影响感染结果及终点菌落形成单位（CFU）。
4. 所有样本造模完成后，用无菌镊子将其转移至24孔板插入物中。用移液器向伤口床加入15 µL细菌接种液。随后，在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育24小时。
5. 若需更长的孵育时间，每24小时更换一次培养基，即移除原有培养基并替换为新鲜培养基，继续在相同条件下孵育。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔配套板	SLS	353504
4 mm活检打孔器	Williams Medical	D7484
50 ml离心管	Fisher Scientific	10788561
8 mm活检打孔器	Williams Medical	D7488
两性霉素B溶液，无菌	Sigma	A2942
Colour Pro Style无线理发剪	Wahl	9639-2117X	理发剪
双温控培养箱	SLS	OVe1020	灭菌烘箱
表皮生长因子	SLS	E5036-200UG
乙醇	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM培养基	Sigma	N4888
胎牛血清	Labtech International	CA-115/500
镊子	Fisher Scientific	15307805
脱毛膏	Veet	不适用
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	组织培养箱
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	离心机
24孔插入式培养板，0.4 µm膜	VWR International	353095
重组人胰岛素	SLS	91077C-1G
Medium 199（MK培养基）	Sigma	M0393
Costar 96孔细胞培养板	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	不适用	细菌培养箱
PBS片剂	Sigma	P4417-100TAB
青霉素-链霉素	SLS	P0781
板封膜	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	II级微生物安全柜
15号手术刀片	Fisher Scientific	O305
Swann Morton手术刀	Fisher Scientific	11849002
碳酸氢钠	Sigma	S5761-1KG
带齿Allis组织镊	Rocialle	RSPU500-322
胰蛋白胨大豆肉汤	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba片剂	Quip Labs	VMTAB75BX