一种利用CRISPR Cas9对自然杀伤细胞进行基因编辑的技术

摘要

来源：Naeimi Kararoudi, M.，等。利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人NK细胞。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种利用Cas9核糖核蛋白介导对原代自然杀伤（NK）细胞进行基因修饰的技术。通过电穿孔将Cas9核糖核蛋白导入原代自然杀伤细胞，该核糖核蛋白由Cas9核酸内切酶与引导RNA（gRNA）结合而成，其中引导RNA通过CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（tracrRNA）的碱基配对形成。该核糖核蛋白可靶向并切割宿主DNA的特定靶位点，借助细胞修复机制对目标基因进行修饰，从而实现基因敲除。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 人NK细胞的分离与扩增

1. 从血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMC）。
   1. 将35 mL血沉棕黄层样本叠加在15 mL Ficoll-Paque 液体上。
   2. 以400 × g离心20分钟（不启用刹车），从界面处收集PBMC。
   3. 用至少等体积的PBS重悬回收的PBMC，以400 × g离心5分钟，重复洗涤三次，并吸除PBMC洗涤液。此时可通过RosettesSep法分离NK细胞。
2. 在第0、7和14天，使用照射处理的表达mbIL21的饲养细胞（10 × 10⁶）刺激NK细胞进行扩增。每隔一天更换新鲜RPMI培养基，培养基含10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和100 IU/mL IL-2，更换体积为全部培养基体积。

2. gRNA 的设计与选择

1. 选择要靶向的特定基因组位点，使用在线工具， 例如， NCBI，Ensemble
   示例。
   描述：转化生长因子β受体2（TGFBR2）胞外域
   查看记录：PF08917
   查看 InterPro：IPR015013
   位置：49 - 157 个氨基酸
   靶向序列：TGFBR2 基因（ENSG00000163513）的第4外显子
2. 设计gRNA时，可使用CRISPR设计网络工具，如http://crispr.mit.edu 和 'Benchling'。
   1. 输入所选的 DNA 序列 步骤 2.1选择人类基因组（hg 19）作为目标基因组。将对先前输入的序列扫描 CRISPR 引导序列（20 个核苷酸，后跟原间隔序列邻近基序（PAM）序列：NGG），并显示在整个选定基因组中可能的脱靶匹配位点。
   2. 根据靶上和脱靶率选择得分最高的三个gRNA。例如， 表1 显示了由CRISPR设计网络工具推荐的靶向TGFBR2基因第4外显子的CRISPR RNA设计序列。
3. 订购合成的序列特异性crRNA作为CRISPR RNA。
4. 订购一条保守的反式激活RNA（tracrRNA），通过与crRNA的部分同源性相互作用。

3. 设计缺失筛选引物

1. 设计跨越gRNA切割位点的引物用于T7E1突变检测。
2. 引物应位于预测切割位点至少100 bp以外，以确保在突变检测后，sgRNA靶位点的小片段插入-缺失（indels）能够在1.5%琼脂糖凝胶上显现。表2列出了用于扩增TGFBR2胞外域的引物。

4. 人原代及扩增自然杀伤细胞的转导

注意：使用4D系统通过电穿孔将Cas9/RNP元件转导至NK细胞，操作步骤如下。

1. 细胞准备
   1. 对于原代自然杀伤细胞（NK细胞），将新分离的NK细胞在含100 IU/mL IL-2的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中培养4天，并于第5天进行电穿孔。每隔一天更换一次培养基，具体操作如前所述，并在转导前一天更换培养基。
   2. 对于扩增后的NK细胞，在第0天以1:1的比例用经辐照的饲养细胞刺激细胞，并在第5、6或7天进行电穿孔。每隔一天更换一次培养基，具体操作如前所述，并在转导前一天更换培养基。
   3. 在进行电穿孔当天，为接受电穿孔的细胞准备一个装有8 mL新鲜RPMI培养基（含100 IU/mL IL-2）的T25培养瓶，并将培养瓶预先置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育。
      注意：解冻后的细胞或已完成第二次或第三次刺激的细胞，可在恢复生长后的任意时间进行电穿孔，具体操作如前所述。
   4. 每种实验条件取3 - 4 × 10⁶个细胞，用于制备26 µL的转导混合液。
      注意：电穿孔溶液中NK细胞浓度过高可提高转导效率。
   5. 用PBS洗涤细胞3次，以彻底去除含有常见RNase活性的胎牛血清（FBS）。每次离心条件为300 × g，离心8分钟。
      注意：建议设置7种电穿孔条件，包括Cas/RNP单独使用单个gRNA（gRNA1、gRNA2、gRNA3），以及两种gRNA的组合（gRNA1+gRNA2、gRNA1+gRNA3、gRNA2+gRNA3），另设一组不添加Cas9/RNP的对照组。
2. 形成crRNA:tracerRNA复合物
   1. 将crRNA（gRNA1、gRNA2和gRNA3）与tracerRNA用1× TE溶液重悬，终浓度为200 μM。按照表3所示，将每种200 μM的gRNA各取2.2 μL与200 μM的tracerRNA混合。
   2. 将样品在95 °C加热5分钟，随后在室温（15 - 25 °C）下静置冷却至室温。将重悬后的RNA及crRNA:tracrRNA复合物储存于-20 °C，以备后续使用。
3. 形成RNP复合物
   注意：为节省时间，可在洗涤步骤4.1.5期间同步进行RNP复合物的制备。
   1. 对于单个crRNA:tracrRNA双链反应，将Cas9核酸酶稀释至36 μM，具体操作参见表4中的示例。
   2. 对于crRNA:tracrRNA双链的组合转导，将Cas9核酸酶稀释至36 μM，具体操作参见表5中的示例。
   3. 在轻轻旋转移液枪头的同时，缓慢将Cas9核酸酶加入crRNA:tracrRNA双链中，持续30秒至1分钟。
   4. 室温孵育混合物15 - 20分钟。若孵育后暂不使用，应将混合物置于冰上保存直至使用。
4. 电穿孔
   1. 将全部添加剂加入电穿孔溶液P3中，并置于室温备用。
   2. 将细胞沉淀（来自步骤4.1.5的3 - 4 × 10⁶个细胞）重悬于20 μL的P3原代4D电穿孔溶液中。移液时避免产生气泡。
      注意：细胞在P3溶液中不宜长时间停留。
   3. 立即将5 µL RNP复合物（步骤4.3）加入细胞悬液中。
   4. 向Cas9/RNPs/细胞混合物中加入1 μL的100 μM Cas9电穿孔增强剂。
   5. 将Cas9/RNPs/细胞混合物转移至20 μL电穿孔槽中。
   6. 轻轻敲击电穿孔槽，确保样品均匀覆盖槽底。
   7. 启动4D电穿孔系统，并选择EN-138程序。

表1. 三种设计的gRNA，用于靶向TGFBR2胞外域的第4外显子，作为合成crRNA。

gRNA 编号	gRNA 序列	作为合成 crRNA 订购
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/
gRNA2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/
gRNA3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

表2. 用于扩增TGFBR2胞外域基因的引物

TGFBR2 胞外域 引物 正向	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 胞外域 引物 反向	5 GGG CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3

表 3. 使用 200 µM RNA 形成 crRNA:tracrRNA 复合物

组分	体积 (µL)
200 µM crRNA	2.2
200 µM Tracer RNA	2.2
IDTE缓冲液	5.6
最终产物	10

表4. 对于单个crRNA:tracrRNA双链反应，将Cas9内切酶稀释至36 µM。

组分	体积 (µL)
PBS	1
crRNA:tracrRNA 双链（来自步骤 4.2）	2 (200 pmol)
Alt-R Cas9 内切酶（61 µM 原液）	2
总体积	5 µL

表5. 对于crRNA:tracrRNA双链的组合转导，将Cas9核酸酶稀释至36 µM。

组分	体积 (µL)
PBS	1
crRNA:tracrRNA 双链（例如 gRNA1）	1 (100 pmol)
crRNA:tracrRNA 双链（例如 gRNA2）	1 (100 pmol)
Alt-R Cas9 内切酶	2
总体积	5 µL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RosetteSep™ 人NK细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies	15065	RosetteSep™ 人NK细胞富集试剂盒旨在通过负向选择法从全血中分离NK细胞。
Ficoll-Paque® PLUS	通用电气医疗集团 - 生命科学	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Integrated DNA Technologies	1072532	含有专有化学修饰的tracrRNA，可增强核酸酶抗性；与crRNA杂交以激活Cas9酶
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Integrated DNA Technologies		基于靶向目的基因的gRNA设计序列，由Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA人工合成制备
Alt-R® 基因组编辑检测试剂盒	Integrated DNA Technologies	1075931	每个试剂盒包含T7EI内切酶、T7EI反应缓冲液和T7EI检测对照品。
Platinum® Taq DNA聚合酶高保真酶	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector™ 系统	Lonza	AAF-1002B
人重组IL-2蛋白	诺华	65483-0116-07
P3 原代细胞 4D-Nucleofector™ X 试剂盒	Lonza	V4XP-3032	包含 pmaxGFP™ 载体、Nucleofector™ 溶液、辅助试剂、16 孔 Nucleocuvette™ 条状杯
非靶向：定制 siRNA，标准 0.05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 3NLS	Integrated DNA Technologies	1074181	Cas9 核酸酶
DNeasy® 血液 & 组织手册	Qiagen	69504
RNeasy Mini试剂盒	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 对照试剂盒，人源	Integrated DNA Technologies	1072554	包含 tracrRNA、HPRT 阳性对照 crRNA、阴性对照 crRNA#1、HPRT 引物混合液及无核酸酶双链缓冲液。
IDTE pH 7.5（1X TE 溶液）	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 电穿孔增强剂	Integrated DNA Technologies	1075915	Cas9 电穿孔增强剂