生成用于疫苗的重组减毒活流感病毒

Abstract

来源:Pérez-Girón， J. V. et al， 在嵌合小鼠模型中鼻内接种重组流感疫苗以研究粘膜免疫。J. Vis. Exp. （2015 年）

该视频展示了一种制造感冒适应重组流感病毒的方法。它包括用双向质粒转染人类细胞，然后在较低温度下孵育以产生适合疫苗生产的病毒，其特征是在温暖的条件下减少复制。

Protocol

1. 通过反向遗传学制备重组减毒活流感疫苗

注意:通过反向遗传学生成重组流感病毒的详细方案已在以前的研究中描述，超出了本报告的范围。简而言之，感冒适应流感疫苗 （CAV） 的抢救是在生物安全 2 级 （BSL2） 遏制下的生物安全 II 级柜中进行的，涉及如下详述的步骤。

1. 以寒冷适应菌株 A/Ann Arbor/6/60 （H2N2） 以及血凝素 （HA） 和修饰的神经氨酸酶 （NA） 为 A/PR/8/34 （H1N1） 菌株为背景，生成重组寒冷适应流感疫苗（图 1A）。NA 基因的修饰包括用编码鸡卵清蛋白 （OVA） 衍生肽 SIINFEKL 的短 cDNA 序列（图 1B）替换蛋白茎中的保守序列（残基 65 至 72）中的保守序列（图 1B）。SIINFEKL 肽在 C57BL/6 小鼠的 H-2b MHC I 类限制性反应的背景下是一种高度免疫显性肽。
2. 使用 DMEM 10% 胎牛血清 （FBS） 补充 1% 青霉素/链霉素 （P/E），在 6 孔板中每孔接种 10⁶ 293T 细胞。
3. 制备质粒转染混合物:加入 1 μg 编码 PB2、PB1、PA、NP、M、NS cDNA 的质粒，分别来自 A/Ann Arbor/60 毒株和 1 μg 编码 NA....

Results

图 1.可追溯 LAIV 的工程设计。（A） 使用 Lipofectamine 2000 将 Ambisense 质粒中克隆的流感片段转染到 293T 细胞中。转染后 24 小时，在 1% TPCK 胰蛋白酶存在下，使用从 293T 细胞获得的上清液包被流感允许的 Madin-Darby 犬肾 （MDCK） 细胞。所有方案均在 33 °C 下进行，然后将来自 MDCK 细胞的病毒上清液接种到 9 日龄的胚胎鸡蛋中，在 33 °C 下接种 3 天。（B） 为了将 OVA 衍生的 SIINFEKL 肽插入流感神经氨酸酶 （NA） 中，替换了 A/Puerto Rico/8/34 （H1N1） 病毒 NA 基因的保守区域（残基 65 至 72）通过融合 PCR 编码 SIINFEKL 肽的短 cDNA。

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Materials