生成用于疫苗的重组减毒流感病毒

摘要

来源：Pérez-Girón, J. V. 等，利用嵌合小鼠模型经鼻给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了一种构建耐冷重组流感病毒的方法。该方法包括将双向质粒转染至人源细胞，随后在较低温度下孵育，以获得适用于疫苗生产的病毒，这些病毒在较高温度条件下复制能力降低。

方案

1. 利用反向遗传学技术构建重组减毒流感疫苗

注意： 重组流感病毒的反向遗传学生成详细方案已在先前的研究中描述，不在本报告的范围之内。简而言之，冷适应流感疫苗（CAV）的拯救操作在生物安全二级（BSL2）防护条件下的生物安全二级柜中进行，具体步骤如下所述。

1. 利用冷适应株 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 作为背景，结合 A/PR/8/34 (H1N1) 毒株的血凝素（HA）和一种修饰后的神经氨酸酶（NA），构建重组冷适应流感疫苗（图1A）。NA 基因的修饰是通过 PCR 方法将蛋白茎部一段保守序列（第65至72位氨基酸）替换为编码鸡卵清蛋白（OVA）来源肽段 SIINFEKL 的短cDNA序列（图1B）。SIINFEKL 肽段在 C57BL/6 小鼠 H-2b MHC I 类限制性免疫应答中具有高度免疫优势性。
2. 在6孔板中，以含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/E）的DMEM培养基，每孔接种10⁶个293T细胞。
3. 制备质粒转染混合物：分别加入编码流感A/Ann Arbor/6/60株PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因cDNA的质粒各1 µg，以及编码流感A/PR/8/34株NA-SIINFEKL和HA的质粒各1 µg；再加....

结果

图1. 可示踪LAIV的构建。 (A) 将克隆至双义质粒中的流感病毒基因片段使用Lipofectamine 2000转染293T细胞。转染24小时后，收集293T细胞上清液，并在含1% TPCK胰蛋白酶的条件下用于感染易感的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。整个操作在33 °C下进行。MDCK细胞产生的病毒上清液随后接种至9日龄鸡胚中，在33 °C下孵育三天。通过基于PCR的病毒基因组扩增及测序确认病毒拯救成功。 (B) 为将OVA来源的SIINFEKL肽段插入流感病毒神经氨酸酶（NA）中，利用融合PCR技术，将A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)病毒NA基.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM 1X）	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
Opti MEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamine 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	PAA	p11-010
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
胰蛋白酶-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426