肿瘤类球体中浸润性T细胞的三维共培养模型

摘要

来源：Lin, Y., 等. 在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞杀伤活性. J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种建立三维肿瘤球体与T细胞共培养的方法。首先制备含有肿瘤球体的琼脂糖微孔模具，随后加入T细胞。经过孵育后，该体系可在可控的三维环境中研究T细胞与肿瘤球体之间的相互作用。

方案

1. 类球体的生成

1. 配制2%琼脂糖并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶解（例如，1 g琼脂糖溶于50 mL 1× PBS中），并对琼脂糖溶液及35孔和81孔橡胶模具进行高压灭菌。
   注意：避免使用低熔点琼脂糖制备用于免疫组织化学（IHC）处理的琼脂糖模具。
2. 制备琼脂糖模具
   说明：35孔琼脂糖模具用于侵袭实验、免疫荧光（IF）、细胞分离实验；81孔琼脂糖模具用于细胞毒性、免疫组织化学（IHC）、细胞分离及核糖核酸（RNA）提取实验。
   1. 琼脂糖高压灭菌后，使其熔融状态冷却至约60‒70 °C。在细胞培养超净台内，采用无菌操作技术，将500 µL熔融琼脂糖加入每个81孔橡胶模具的孔中，或将330 µL加入每个35孔橡胶模具的孔中。
      注意：混合或移液过程中避免产生气泡。如有气泡，可轻轻吹打去除。
   2. 待琼脂糖完全凝固后，小心弯曲橡胶模具以将琼脂糖模具从模具中取出。操作时将手置于相应孔板上方，使琼脂糖模具直接落入孔板的一个孔中。
      说明：应从不同位置交替弯曲橡胶模具，避免局部过度弯折。同时从底部轻轻推动可能有助于顺利脱模。
   3. 为平衡琼脂糖模具，加入含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为细胞培养基（12孔板每孔2.5 mL，24孔板每孔1 mL）。将孔板放入细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育1小时。
3. 同时，准备用于接种的细胞培养物。
   说明：每块琼脂糖模具的总接种细胞数由研究者自行决定。对于小鼠原代胰腺癌细胞系，在后续所有实验中，35孔模具接种35,000个细胞，81孔模具接种81,000个细胞（平均每个类球体约1,000个细胞）。接种后48小时，类球体的平均直径约为150‒200 µm。
4. 首先将孔板倾斜，用P1000移液器移除琼脂糖模具周围的培养基，然后小心吸除接种腔内的培养基。
5. 将制备好的肿瘤细胞悬液小心地逐滴接种至接种腔中。随后将孔板小心放回细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育15分钟。
   说明：在此步骤中，细胞将沉降至琼脂糖模具的微孔中。
6. 向琼脂糖模具外侧补充培养基（12孔板每孔2.5 mL，24孔板每孔1 mL）。
7. 将孔板重新放回细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育48小时。
   说明：通常需要数小时，细胞才能在微孔中形成类球体。一般情况下，实体瘤细胞类球体在24小时后形成，并在48小时后趋于稳定。但不同细胞系之间可能存在差异。如有必要，可通过轻轻倾斜带有琼脂糖模具的孔板，并用P1000移液器小心吸除周围培养基的方式更换培养基，然后沿孔壁缓慢加入新鲜培养基。由于模具内体积较小且存在移除类球体的风险，通常无需更换模具内部的培养基。

2. 与T细胞共培养

1. 将所需数量的T细胞重悬于75 µL（35微孔胶模）或190 µL（81微孔胶模）的适当T细胞培养基中（RPMI添加10%胎牛血清和100单位/mL青霉素/链霉素）。
2. 首先将培养板倾斜，用P1000移液器吸除琼脂糖胶模周围的细胞培养基。然后用另一只手保持培养板倾斜，同时用P200移液器缓慢而小心地对准接种腔室的一个角落，吸除腔室内的培养基。
3. （关键步骤1）由于存在移除类球体的风险，需在显微镜下以10倍放大倍数观察并比较更换培养基前后微孔中类球体的数量，以检测类球体是否丢失。
4. 手持P200移液器，距离胶模约0.5 cm，将T细胞悬液逐滴小心地接种至琼脂糖胶模的接种腔室中。
5. （关键步骤2）添加T细胞时存在将类球体冲出的风险。因此，必须非常缓慢地添加T细胞，并保持移液器距离接种腔室约0.5 cm。
   注意：一种减少类球体被冲出的方法是在添加T细胞时将移液器对准接种腔室的一个角落，从而仅使该角落的类球体面临被冲出的风险。
6. 小心将培养板放回细胞培养孵育箱（37 °C，5% CO₂）中孵育15分钟。
7. 从孵育箱中取出培养板，沿孔壁缓慢地用移液器将新鲜细胞培养基（RPMI培养基添加10%胎牛血清和100单位/mL青霉素/链霉素）加至琼脂糖胶模周围。
8. 将培养板放回细胞培养孵育箱中继续孵育 48小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 培养皿	Microtissues 公司	Z764019 & Z764051	称为 "橡胶模具" 在实验方案中；81-微孔 & 35-微孔模具
8孔板载玻片	Lab-Tek	154534
琼脂糖I型，低电渗流动（EEO）	Sigma-Aldrich	A6013
DMEM，胎牛血清	ThermoFisher	11965092, 16000044	称为 "细胞培养基" 在实验方案中
RPMI	ThermoFisher	11875093	用于T细胞培养基