经皮穿刺介导的免疫相关基因递送至小鼠皮肤组织

摘要

来源：Lin, Y., 等，开发一种经济高效的“针刺转染”DNA递送系统及其在皮肤研究中的应用。视觉化实验杂志 (2017)

该视频展示了一种通过微针针灸将编码白细胞介素-15的质粒DNA直接导入白细胞介素-15缺陷型小鼠模型皮肤组织的方法。这些微针可在皮肤最外层产生微小穿孔，促进质粒DNA被皮肤组织中的表皮细胞（包括角质形成细胞）吸收并实现转染。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. Acufection 操作步骤

注意：不同基因所需的最适DNA量及目标皮肤表面积可能有所不同，需进一步优化。刺入力度以及松解皮肤角质层的次数也可能因皮肤厚度不同而有所变化。这些条件必须在通过qRT-PCR评估转染基因转录本的表达水平后，谨慎确定。

1. 称重小鼠，并通过腹腔注射给予三溴乙醇（每克体重400 μg）。
   注意：2,2,2-三溴乙醇是一种可注射的麻醉剂，常用于小鼠。麻醉液的配制方法为：将非药用级2,2,2-三溴乙醇（2.5 g）溶解于含有2.5% 2-甲基-2-丁醇的蒸馏水（200 mL）中。
2. 在眼睛上涂抹兽用眼科软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
   注意：麻醉作用通常在1–2分钟内起效。在手术前，通过检查脚趾夹捏反射来确认麻醉深度是否足够。
3. 剃除背部侧 flank 皮肤的毛发，并涂抹脱毛膏以溶解毛干中的角蛋白。
   注意：使用脱毛膏去除毛发有助于将DNA更有效地导入皮肤。
4. 用浸水的棉球擦拭去除脱毛膏。
   注意：脱毛膏可溶于水。彻底清除脱毛膏可避免皮肤表面油腻，确保后续穿刺效果更佳。
5. 使用浸有70%乙醇的无菌棉签对皮肤表面进行消毒。
6. 使用预先测量好的模板在脱毛后的皮肤上标记目标区域（1 cm × 1 cm）。注意：标记目标区域有助于在限定范围内上下移动针束进行穿刺。这对于确保每次实验向相同表面积递送等量DNA至关重要，从而减少实验间差异。
7. 将10 μL质粒DNA（10 μg）液滴滴加至标记区域的皮肤上。
   注意：电穿刺法（acufection）所用DNA的量因不同基因及表达载体类型而异。在开展目标实验前，应仔细滴定确定最佳DNA用量。10 μL为较小液滴，可在剃毛和脱毛后的皮肤上稳定停留而不滚动，便于穿刺操作。应设置对照组小鼠，注射10 μL空载体DNA，以便与接受目标基因电穿刺的小鼠进行比较。
8. 手持针灸针束（图1B），在标记区域以垂直上下穿刺方式操作100次，或持续至PBS中的DNA液体在皮肤表面完全消失。注意：皮肤表面可能出现轻微发红。应避免造成深部切割导致出血。
   皮肤表面穿刺次数的操作依据是PBS中DNA溶液（10 μL）在皮肤上完全消失。我们选择在30秒内穿刺100次，因其在电穿刺递送基因实验中结果最为稳定。如条件允许，同一针束最多可重复用于6个目标皮肤区域（每个区域1 cm × 1 cm）。每次电穿刺之间需用70%乙醇和PBS冲洗针具。当针头变钝或更换不同质粒DNA时，应更换新针具，以防交叉污染。
9. 将完成电穿刺的小鼠置于加热垫上，维持体温直至苏醒。
10. 当小鼠恢复足够意识后，将其放回饲养笼。注意：应将接受电穿刺的小鼠单独饲养（每笼不超过5只），与未接受电穿刺的小鼠分笼饲养。
11. 放置好饮水瓶，并将笼具放回独立通风笼具（IVC）架上。

2. 术后护理

1. 手术后前 48 小时内，需密切观察小鼠是否出现不适症状，包括行为改变（如焦躁不安、激动或进食障碍）或外观异常（如毛发粗糙或弓背姿势）。

结果

图1. 针灸针示意图。（A） 针灸针（36 G × 0.5"）由针柄和针尖两部分组成。（B） 使用胶带将十根针灸针捆绑成束。通过标尺测量（下图），该束针的长度约为 4 cm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accu Handy 针头	Accu	36Gx0.5	医疗器械
NairTM 脱毛乳液	Church & Dwight	N/A	用于脱毛
Shandon Xyline 替代液	Thermo Fisher Scientific	6764506	脱蜡
Avertin (2,2,2-三溴乙醇)	Sigma-Aldrich	T4,840-2	麻醉剂
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463	用于溶解 Avertin 的溶剂
QIAGEN® 质粒中量提取试剂盒	QIAGEN	12143	从大肠杆菌中纯化质粒 DNA
小鼠 IL-15/IL-15R 复合物 ELISA Ready-SET-Go 试剂盒	eBioscience	88-7215	检测 IL-15 蛋白