一种体外评估肿瘤特异性CAR T细胞抗肿瘤活性的实验方法

摘要

来源：Kueberuwa, G.，等。一种用于CD19 CAR T细胞临床前评价的同源小鼠B细胞淋巴瘤模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种 体外 验证嵌合抗原受体（CAR）T细胞活性的检测方法。表达CD19抗原和胞质荧光素酶的B细胞淋巴瘤细胞与靶向CD19的CAR T细胞共培养。CAR与肿瘤细胞表面CD19结合后，可激活CAR T细胞释放细胞因子和毒素，导致肿瘤细胞发生细胞毒性。通过定量检测CAR T细胞释放的细胞因子水平以及肿瘤细胞中荧光素酶介导的生物发光信号的减弱，评估CAR T细胞的活性。

方案

1. 体外 验证CAR T细胞活性

1. 以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种表达或不表达荧光素酶的同系靶向 CD19+ 肿瘤细胞⁴ 100 μL 完全T细胞培养基（TCM）/孔，置于96孔圆底组织培养板中
2. 加入 1 × 10⁴ 每孔加入100 μL体积的CD19 CAR T细胞，使效应细胞与靶细胞（E:T）比例达到1:1。
   注意： 应针对每种CAR构建体和靶细胞系确定E:T比例。
3. 单独使用T细胞和肿瘤细胞作为干扰素-γ（IFNγ）释放的阴性对照，使用佛波酯-豆蔻酸-乙酸盐（PMA）（50 ng/mL）和离子霉素（ionomycin）（1 μg/mL）刺激的T细胞作为阳性对照。将共培养细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 16-24 小时。
4. 共培养后，将培养板在500 × g下离心5分钟，收集上清液用于后续的IFNγ和IL-12p70 ELISA分析。
   注意： 可保存于 -80 °C。
5. 将细胞沉淀重悬于100 μL含荧光素（终浓度1.5 mg/mL）的PBS中。37 °C孵育10分钟，随后使用合适的发光仪检测每孔的发光信号。
   注意：....

结果

图 1. CAR T 细胞活性的验证。 αmCD19 CAR T 细胞与经修饰表达荧光素酶的 A20 淋巴瘤细胞在 U 型底 96 孔板中以 1 × 10⁴:1 × 10⁴ 的比例共培养 16 小时。共培养后，细胞经离心收集，上清液被分离。 A) 细胞重悬于 PBS 中，采用发光检测法评估靶细胞的存活率。共培养上清液用于检测 IFNγ（B）和 IL-12（C）的含量。CAR T 细胞与靶细胞的比例以及共培养时间需根据每种 CAR 构建体和靶细胞系进行优化。PMA 与离子霉素处理可作为阳性对照.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100X 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）	Gibco	10378016
流式细胞仪 - LSR Fortessa x20	BD Biosciences	658222R1
胎牛血清	Gibco	10270
小鼠 IL-12 p70 未包被 ELISA 试剂盒	Invitrogen	88-7121-76
离子霉素钙盐	Sigma- Aldrich	I0634
发光仪 - Lumistart Omega	BMG Labtech	415-301
小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒	Diaclone	861.050.010
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma- Aldrich	P8139
RPMI 1640 培养基	Lonza	BE12-167F
XenoLight D-荧光素	Perkin Elmer	122799