一种用于评估自然杀伤细胞对癌细胞细胞毒性的体外检测方法

摘要

来源：Baik, C. H.，等。一种基于培养板的细胞毒性检测方法用于评估大鼠胎盘自然杀伤细胞的杀伤功能。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了如何进行乳酸脱氢酶释放实验，以测定自然杀伤（NK）细胞对靶向癌细胞的细胞毒性。该实验通过测量所形成的红色产物的吸光度，来定量癌细胞释放的胞质乳酸脱氢酶酶活性。

方案

1. 细胞毒性检测：实验方案

1. 使用圆底、经培养处理的 96 孔板，按照 表 1 所示设置实验孔。该表列出了实验对照组和 3 组 NK 实验列。此设置可在 96 孔板中扩展至最多 10 组 NK 实验列。
2. 将检测板在 250 × g 条件下离心 4 分钟，以确保效应细胞与靶细胞充分接触。随后将 96 孔板置于 37 °C、5% CO₂ 的加湿孵育箱中孵育 5 小时，以实现靶细胞与效应细胞之间的充分接触及效应细胞对靶细胞的裂解。
   注意： 此处可暂停实验流程。
3. 在收集上清液前 45 分钟，向靶细胞最大 LDH 释放孔（1E、1F、1G 和 1H 孔）中各加入 10 μL 的 10× 裂解液，并将板放回加湿孵育箱中。
4. 孵育结束后，将板在 250 × g 条件下离心 4 分钟。使用多通道移液器，从所有孔中转移 50 μL 上清液至新的 96 孔平底检测板。
   注意： 操作时勿触碰孔底，以免将细胞转移至新的检测板中。新的检测板不可使用经培养处理的板。

2. 配制检测试剂。

1. 当检测缓冲液达到室温后，向一瓶底物混合物中加入 12 mL 检测缓冲液。轻轻倒置并摇晃，直至完全溶解。一瓶足够用于两块 96 孔板。
   注意：检测缓冲液在解冻过程中应避光保存。使用前立即混合。
2. 向第 4.6 步的检测板所有孔中加入 50 μL 检测试剂。用铝箔覆盖板子以避光，并在室温下孵育 30 分钟。
   注意：新配制的检测试剂应保存在冷冻器中。试剂可稳定约 8 周。
3. 向每孔中加入 50 μL 终止液。加入终止液后 1 小时内读取板子，并记录 490 nm 处的吸光度。
   代表性数据见表 2。

表1： 检测板布局。TCS = 靶细胞自发性LDH释放（50 μL 靶细胞 + 50 μL 靶细胞培养基）；TCM = 靶细胞最大LDH释放（50 μL 靶细胞 + 50 μL 靶细胞培养基）；VCC = 体积校正对照（50 μL 靶细胞培养基 + 50 μL NK细胞培养基）；CMB = 培养基背景对照（50 μL 靶细胞培养基 + 50 μL NK细胞培养基）；ECSR = 效应细胞自发性释放（50 μL NK细胞 + 50 μL NK细胞培养基）；EW = 实验孔（50 μL 靶细胞 + 50 μL NK细胞）。

1	2	3	4	5
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
传统中医	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
传统中医	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
传统医学	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
传统中医	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

表2：包含实验对照孔（第1列和第2列）以及实验孔的检测板原始吸光度数据，用于测定来自正常妊娠（NP）和RUPP大鼠胎盘自然杀伤细胞对YAC1靶细胞的细胞毒性。

1	2	3	4	5
		NP	RUPP	NP
0.615	0.484	0.473	0.463	0.471
0.586	0.484	0.458	0.474	0.469
0.61	0.486	0.464	0.459	0.469
0.605	0.55	0.524	0.526	0.543
0.576	0.504	0.519	0.502 0.528	00.528
0.565	0.512	0.515	0.513	0.531
0.563	0.581	0.526	0.508	0.519

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔组织培养板	CELLTREAT	229190	无菌，圆底
细胞刮刀	Fisher	8100241
Cytotox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒	Promega	G1780
RPMI	Gibco	11875135	1640培养基
YAC-1细胞	ATCC	TIB-160