一种用于分子延迟爆发释放的新型递送平台的制备技术

摘要

来源：Arun Kumar, S. 等，近红外敏感核壳疫苗递送平台的制备 ，《视觉化实验杂志》（2020）

本视频展示了一种用于构建聚合物气泡（polybubble）新型平台的方法，该平台可实现延迟爆裂释放。采用聚酯类聚合物形成具有核-壳结构的聚合物气泡，并可将小分子和抗原作为载荷物质。

方案

1. 聚己内酯三丙烯酸酯（PCLTA）的合成

1. 将 3.2 mL 分子量为 400 Da 的聚己内酯三醇（PCL 三醇）在 50 °C 条件下于敞口的 200 mL 圆底烧瓶中干燥过夜，同时将碳酸钾（K₂CO₃）置于玻璃小瓶中在 90 °C 下干燥。
2. 在氩气氛围下，将该三醇与 6.4 mL 二氯甲烷（DCM）及 4.246 g K₂CO₃ 混合。
3. 将 2.72 mL 丙烯酰氯溶于 27.2 mL DCM 中，然后在 5 分钟内逐滴加入圆底烧瓶中的反应混合物中。
4. 用铝箔包裹反应混合物，在氩气氛围下于室温静置 24 小时。
5. 反应 24 小时后，在减压条件下使用布氏漏斗和滤纸过滤反应混合物，以除去多余的试剂。
6. 将步骤 1.5 所得滤液（含有封端聚合物）在二乙醚中以 1:3（体积比）的比例沉淀，并在 30 °C 下旋转蒸发以除去二乙醚。

2. 多重气泡的形成

注意：将聚合物注入去离子水（DI水）中会导致聚泡迁移至小瓶底部，从而形成扁平的底部。应使用10%（重量/体积）的羧甲基纤维素钠（CMC）填充玻璃小瓶，以避免聚泡变形。

1. 在去离子水中配制10%（wt/vol）的羧甲基纤维素钠（CMC）溶液。
2. 使用1 mL移液管将0.8 mL的10% CMC溶液加入0.92 mL玻璃小瓶中。
3. 将1000 mg/mL的14 kDa聚己内酯（PCL）溶于二氯甲烷（DCM）中，并以1:3（vol/vol）的比例合成PCLTA，总体积为200 µL；或在氯仿中配制200 µL的1000 mg/mL的5 kDa聚（乳酸-共-乙醇酸）二丙烯酸酯（PLGADA）。
4. 将2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（光引发剂）与聚合物（PLGADA或PCL/PCLTA）混合物按0.005:1（vol/vol）的比例混合。
5. 将200 µL聚合物混合物装入安装在注射泵上的1 mL玻璃注射器中，该注射器连接内径为0.016英寸的不锈钢分配管。
6. 使用微型电机控制聚合物管的前后运动，将聚合物注入玻璃小瓶中的10% CMC溶液中，以形成聚泡（polybubble）。
7. 在波长254 nm的紫外光（UV）下，以2 W/cm²的强度照射60秒，使聚泡固化。
8. 将聚泡在液氮中快速冷冻，并在0.010 mBar真空和-85 °C条件下冷冻干燥过夜。
9. 用镊子将聚泡从干燥的CMC中分离，并用去离子水洗涤聚泡以去除残留的CMC。请注意，其他聚合物也可使用，但可能需要进行适当调整以改变释放动力学。

3. 多重气泡直径的调控

1. 使用1 mL移液管将10%羧甲基纤维素（CMC）加入0.92 mL玻璃小瓶中。
2. 将PCL/PCLTA以1:3（体积比）混合，并与1000 mg/mL的14 kDa PCL混合以合成PCLTA。将光引发剂与聚合物混合物按0.005:1（体积比）混合。
3. 将聚合物混合物装入安装在连接内径为0.016英寸不锈钢分配管的注射泵上的1 mL玻璃注射器中。
4. 使用微型电机控制聚合物管的前后运动，将聚合物注入玻璃小瓶中的10% CMC中，以形成聚泡（polybubble）。
5. 为获得不同直径的聚泡，调节分配速率为0.0005至1 µL/s。
6. 拍摄含有不同直径聚泡的小瓶图像。
7. 使用ImageJ量化聚泡的直径，并以小瓶尺寸作为标尺。

4. 在多泡内对货物进行居中定位

1. 使用 K₂CO₃ 调控 PCL/PCLTA 的黏度：        
   注意：PLGADA 的黏度无需使用 K₂CO₃ 进行调节，因为 1000 mg/mL 浓度下分子量为 5 kDa 的 PLAGDA 其黏度已足以使载荷居中。
   1. 将 PCLTA 反应后分离得到的 K₂CO₃ 以不同浓度（包括 0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 和 60 mg/mL）加入 PCLTA 中。
   2. 使用流变仪测量溶液的动态黏度，剪切速率范围设定为从 0 到 1000 1/s。
   3. 将载荷（参见步骤 4.2 制备载荷混合物）手动注入由不同 K₂CO₃ 浓度的 PCL/PCLTA 溶液形成的聚泡中心（步骤 4.1.1）。通过观察步骤 4.1.1 中哪种溶液能使载荷保持在中心位置，确定 K₂CO₃ 的最佳浓度。
2. 使用 CMC 实现载荷居中（已证实小分子可行）
   1. 将载荷与 5%（wt/vol）CMC 在旋转仪中混合过夜，以提高载荷的黏度。
   2. 将 2 µL 载荷混合物手动注入聚泡中，并在 254 nm 波长、2 W/cm² 条件下进行 60 秒紫外光固化。
   3. 将聚泡在液氮中快速冷冻 30 秒，随后在 0.010 mBar 真空、-85 °C 条件下冷冻干燥过夜。
   4. 使用镊子将聚泡与干燥的 CMC 分离，并用去离子水洗涤以去除残留的 CMC。
   5. 将聚泡切开成两半，使用共聚焦显微镜对切片成像，确认载荷是否居中（参见步骤 6 中使用的激发和发射波长）。

5. 载体配制

注意： Polybubble 制剂可容纳多种类型的货物，包括小分子、蛋白质和核酸。

1. 根据以往研究，对于蛋白质类货物，可使用包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和糖聚合物在内的辅料 以提高蛋白质在多泡制剂过程中的稳定性。
2. 根据步骤2中的方案制备多聚气泡。
3. 将17.11 g海藻糖加入625 µL HIV gp120/41抗原中，配制抗原溶液。
4. 在聚泡中央手动注入1 µL抗原溶液。
5. 在第0、7、14和21天打开多孔气泡板，记录抗原在激发波长497 nm和发射波长520 nm条件下的荧光。
6. 使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测抗原的功能性，并以5%脱脂牛奶作为封闭缓冲液。

6. 货物释放

注意：小分子或抗原可用作货物类型

1. 小分子
   1. 将负载中心化吖啶橙的聚泡在 400 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育，PLGADA 聚泡在 37 °C 和 50 °C 下孵育，PCL/PCLTA 聚泡在 37 °C、50 °C 和 70 °C 下孵育。
      注意： 建议测试高于体温条件的原因是：a) 模拟在激光照射金纳米棒（AuNRs）时 PCL 和 PLGA 聚泡内部达到的温度（50 °C）；b) 加速 PCL 的降解过程（50 °C、70 °C）。
   2. 在每个时间点，收集上清液，并替换为 400 µL 新鲜 PBS。
   3. 使用酶标仪定量检测所收集上清液中的荧光强度。
      注意： 吖啶橙的激发/发射波长为 416 nm/514 nm。
2. 抗原
   1. 将负载中心化牛血清白蛋白-488（BSA-488）的聚泡在 400 µL PBS 中孵育，PLGADA 聚泡在 37 °C 和 50 °C 下孵育，PCL/PCLTA 聚泡在 37 °C 和 50 °C 下孵育。
   2. 在每个时间点，收集上清液，并替换为 400 µL 新鲜 PBS。
   3. 使用酶标仪定量检测所收集上清液中的荧光强度。BSA-488 的激发/发射波长为 497 nm/520 nm。
      注意： 不应进行 PCL/PCLTA 聚泡在 70 °C 下的释放研究，以避免抗原暴露于极端温度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法超敏四甲基联苯胺（TMB）酶联免疫吸附测定（ELISA）底物溶液	Thermo scientific	34028
2-羟基-2-甲基苯丙酮	TCI AMERICA	H0991
TMB底物用450 nm终止液	Abcam	ab17152
丙烯酰氯	Sigma Aldrich	A24109-100G
吖啶黄	Chem-Impex International	22916
无水乙醚	Fisher Chemical	E138-500
与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗HIV1 gp120抗体
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488染料偶联物	Invitrogen	A13100
羧甲基纤维素（CMC）	Millipore Sigma	80502-040
氯仿	Fisher Chemical	C2984
包被缓冲液	Abcam	ab210899
二氯甲烷（DCM）	Sigma Aldrich	270997-1L
乙醚	Fisher Chemical	E1384
Legato 100 注射泵	KD Scientific	14 831 212
脱脂奶粉	Andwin Scientific	NC9022655
碳酸钾	Acros Organics	AC424081000
磷酸盐缓冲液	Fisher BioReagents	BP3991
聚己内酯（Poly(caprolactone)）	Sigma Aldrich	440744-250G
聚己内酯三醇（Poly(caprolactone) triol）	Acros Organics	AC190730250
聚（乳酸-共-乙醇酸）二丙烯酸酯	CMTec	280050
重组HIV1 gp120 + gp41蛋白	Abcam	ab49054
海藻糖	Acros Organics	NC9022655