一种评估抗癌效果的检测方法 乳酸杆菌 无细胞上清液

摘要

来源：Lee, J.，等。利用益生菌无细胞上清液在结直肠癌细胞三维球体培养物中评估细胞死亡。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种体外实验方法，用于研究抗癌作用 Lactobacillus 无细胞上清液（LCFS）。将结直肠癌类球体暴露于不同剂量的LCFS时，LCFS中的细菌代谢物与癌细胞相互作用，诱导癌细胞发生凋亡，破坏类球体结构，并以剂量依赖的方式导致细胞死亡。

方案

1. 细菌培养及Lactobacillus无细胞上清液（LCFS）的制备

注意：步骤 1.2 – 1.9 需在厌氧环境中进行。

1. 制备含有 L-半胱氨酸的 De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) 琼脂平板和肉汤，并通过高压灭菌进行灭菌。
2. 将 MRS 琼脂平板预先置于维持在 37 ˚C、含 20 ppm 氧气的 H₂ 厌氧培养箱中孵育。
3. 解冻 Lactobacillus 菌种，并将细菌培养物接种至琼脂平板上（图 1A (i)）。
4. 在 H₂ 厌氧培养箱中于 37 ˚C、20 ppm 氧气条件下孵育细菌 2–3 天，直至获得单菌落。
5. 清洗并干燥 Hungate 型厌氧培养管，在 121 ˚C 下高压灭菌 15 分钟。
6. 随后将培养管置于 H₂ 厌氧培养箱中，在 37 ˚C、20 ppm 氧气条件下孵育以去除氧气。
7. 向管中加入 2–3 mL MRS 肉汤，用丁基橡胶塞密封后拧紧盖子。
8. 用接种环挑取单个菌落，并将其放入含有 500 µL 1x PBS 的 1.5 mL 培养管中（图 1A (ii)）。
9. 使用 1 mL 注射器重悬菌落（图 1A (iii)），操作方法为：将 1 mL 注射器针头插入培养管盖中心，吸取悬浮的菌落，再将其重新注入 MRS 肉汤培养基中（图 1A (iv)）。
10. 将 MRS 肉汤培养基于摇床培养箱中孵育 2 天（37 °C，5% CO₂，200 rpm）。
11. 使用分光光度计测定光密度（OD），监测细菌生长曲线，直至 OD₆₂₀ 吸光度达到 2.0。
12. 在 1,000 x g 条件下离心 15 分钟，分离细菌沉淀与条件培养基。用 1x PBS 洗涤收集的细菌沉淀，并重悬于 4 mL 添加了 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中。培养基中不得添加任何抗生素。
13. 将细菌沉淀维持在 RPMI 培养基中，在摇床培养箱中于 37 °C、5% CO₂、100 rpm 条件下孵育 4 小时。
14. 为制备益生菌上清液，于 4 °C 下以 1000 x g 离心 15 分钟去除细菌沉淀。使用 0.22 μm 滤器对回收的上清液进行无菌过滤，并于 −80 °C 保存直至使用。

2. 类球体的生成

1. 准备结直肠癌细胞系​
   1. 将DLD-1、HT-29和WiDr细胞系以单层培养至70-80%融合度，并在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育（培养基：含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基）。
   2. 对于在100 mm培养皿中培养的细胞，用4 mL 1× PBS洗涤两次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2分钟，以解离细胞。
   3. 孵育后，在显微镜下检查细胞解离情况，并加入5 mL培养基中和胰蛋白酶-EDTA。
   4. 将解离后的细胞转移至15 mL锥形管中，以300 x g离心3分钟。
   5. 弃去上清液，用3 mL培养基轻柔重悬细胞。
   6. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数，以确定活细胞数量。（图1B (i)）
2. 类球体形成​
   1. 在15 mL锥形管中，将步骤2.1.5中的细胞稀释至1 - 2 × 10⁵ 个细胞/mL（图1B (ii)）
   2. 向细胞悬液中加入终浓度为0.6%的甲基纤维素，并将稀释后的细胞转移至无菌储液槽中。
      ​注意： 每种细胞系所需的甲基纤维素用量应通过滴定确定。
   3. 使用多通道移液器将200 µL细胞悬液加入超低吸附96孔圆底微孔板的每个孔中。（图1B (iii)）
   4. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24 - 36小时。
   5. 孵育24 - 36小时后，在光学显微镜下观察微孔板，确认类球体的形成。

3. 使用 LCFS 处理三维结直肠癌细胞

1. 按照步骤 2 和 3 所述方法生成球状体。
2. 在进行 LCFS 处理前，将冷冻的 LCFS 在室温（RT）下解冻 10 - 20 分钟。
3. 将 LCFS 储备液接种至生长培养基中，并在生长培养基中依次稀释为 25%、12.5% 和 6%（例如，25% LCFS = 150 µL 生长培养基 + 50 µL LCFS）。
4. 从培养箱中取出含有球状体的细胞培养板，使用 200 μL 移液器尽可能吸除每个孔中的生长培养基。
5. 向细胞中加入含 LCFS 的生长培养基，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 24 - 48 小时。
   注意：所用体积需根据培养板规格确定：6 孔板为 2 mL；96 孔板为 200 μL。

结果

图1：类球体形成及LCFS制备的示意图。

（A）LCFS 生成方案的示意图用（i-iv）标记。（B）甲基纤维素介导的球形体形成示意图用（i-iii）标记。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性封膜	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 片
Axygen 2.0 mL MaxyClear 扣盖离心管，聚丙烯，透明，非无菌，500 管/包，10 包/箱	Corning	SCT-200-C	500 管/包，10 包/箱
BD Difco Bacto 琼脂	BD	214010	500 g
BD Difco 乳酸杆菌 MRS 肉汤	BD	DF0881-17-5	500 g
Corning 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛网扣盖	Corning	352235	25/包，500/箱
胎牛血清，经认证，美国来源	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
盐酸半胱氨酸一水合物	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
甲基纤维素（3500-5600 mPa·s，2% 水溶液，20°C）	TCI	M0185	500 g
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板，带条形码，0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 块
Millex-GS 注射器滤器，0.22 µm，混合纤维素酯，33 mm，环氧乙烷灭菌	Millipore	SLGS033SB	250 个
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
材料/设备/软件
CO2 培养箱	Thermo fisher	HERAcell 150i
15 ml 锥形离心管	SPL	50015
50 ml 锥形离心管	SPL	50050
Corning Costar 超低吸附多孔板	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar 超低吸附多孔板	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL 试剂储液槽，5 个/袋，无菌	Costar	4870
Countess 细胞计数板	Thermofisher	C10228
Countess II FL 全自动细胞计数仪	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire 多功能酶标仪	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus 多通道移液器，8 通道	Eppendorf	3122000051
恒温摇床	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0	Fujifilm		日本东京
光密度（OD）LAMBDA 紫外/可见光分光光度计	Perkin Elmer		美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
相差显微镜	Olympus		日本东京
SPL 微量离心管 1.5 mL	SPL	60015
SPL 多通道储液槽，12 通道，聚苯乙烯，无菌	SPL	21012
Vibra-Cell 超声波液体处理器	SONICS-vibra cell	VC 505	500 瓦超声处理器
乙烯基厌氧培养箱	COY LAB PRODUCTS