开发含有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

摘要

来源：Dagur, R. S. 等，建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种构建双人源化小鼠模型的方法，该模型同时具有人免疫系统和人肝细胞。该方法包括将人肝细胞和造血干细胞与祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内。 关键词：人源化小鼠模型，人免疫系统，人肝细胞，造血干细胞，祖细胞，转基因免疫缺陷小鼠，细胞移植 通过 脾内注射，可导致肝细胞植入及人类免疫细胞发育。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脐带血的处理及人造血干细胞/祖细胞（HSPCs）的分离

1. 所有实验步骤均须在超净工作台内无菌条件下进行。
2. 取肝素抗凝管收集的脐带血（CB），加入磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至 35 mL。如图1所示，将样本平铺于淋巴细胞分离液（LSM）上方，随后将LSM与分层后的脐带血在4 °C条件下以400 x g离心35分钟，离心过程中不启用刹车。
   注意：稀释血液时应小心轻柔操作，避免界面处发生混合。
3. 小心移除上层LSM及血浆层，使用移液管将白色絮状的血沉棕黄层（buffy coat）界面转移至新离心管中。
4. 用30 - 40 mL预冷的缓冲液（PBS + 0.5% 牛血清白蛋白[BSA] + 2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]）重悬血沉棕黄层。用移液器取20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝混合，再吸取10 µL混合液加入细胞计数板两个腔室之一的外侧加样口，将计数板插入自动细胞计数仪中进行细胞计数。
   注意：所有步骤均应使用预冷缓冲液，因其有助于维持细胞活性。
5. 在4 °C条件下以300 x g离心细胞10分钟，小心吸除上清液，随后加入300 µL预冷缓冲液。
6. 每最多1 x 10⁸个细胞中加入100 µL人Fc受体阻断试剂和100 µL单克隆小鼠抗人CD34抗体偶联磁珠（见材料表）。在4 °C孵育30分钟，加入10 mL预冷缓冲液洗涤细胞，然后在4 °C以300 x g离心10分钟。
   注意：若细胞数量超过1 x 10⁸，应按比例放大试剂用量。
7. 小心吸除上清液，将沉淀用500 µL缓冲液重悬，随后进行磁性分离步骤以富集造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。
8. 将阳性选择LS柱（见材料表）置于磁性细胞分选装置的磁场中，并用3 mL缓冲液预淋柱。
9. 将样本加载至LS柱，使与人CD34+结合的磁珠在重力作用下被截留，液体流入收集管中。
10. 用缓冲液洗涤柱子3次，将洗脱液收集至同一收集管中，获得CD34^-细胞组分。
11. 用5 mL缓冲液冲洗柱子，将CD34⁺细胞洗脱至新的收集管中。重复该操作以达到>90%的纯度。
12. 使用台盼蓝染色在血细胞计数板中对洗脱的CD34⁺细胞进行计数。计数后，在300 x g条件下离心CD34⁺细胞5分钟，并弃去上清液。
13. 将CD34⁺ 细胞重悬于25 µL PBS中，立即用于移植注射；或以1-2百万/mL的浓度重悬于冻存液（RPMI 1640培养基[Roswell Park Memorial Institute medium] + 50%胎牛血清[FBS] + 10%二甲基亚砜[DMSO]）中，进行冻存以备后续移植使用。
    注意：移植前务必重新计数活细胞数量。
14. 为检测CD34⁺洗脱液的纯度，取50 µL细胞悬液，加入10 µL藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗人CD34抗体，在4 °C避光孵育30分钟。抗体孵育完成后，用PBS洗涤染色细胞，重悬于100 µL PBS中，随后进行流式细胞术分析。另设一管不加抗体的细胞作为对照，用于流式细胞仪设门。
15. 采集数据后，首先在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图中选择目标区域，接着在FSC-面积与FSC-高度图中设门排除双细胞团，最后在单细胞群体的PE通道与SSC-面积图中圈定CD34阳性细胞。

2. 用于移植的人类肝细胞（HEPs）的制备

1. 从液氮中取出冷冻保存的肝细胞，迅速将冻存管浸入水浴中，解冻约 90 - 120 秒。
2. 打开管盖，将解冻后的肝细胞倒入装有预温解冻培养基的 50 mL 圆锥形离心管中。
3. 用手轻轻晃动 50 mL 管数秒钟，使细胞重悬。
   注意：切勿涡旋振荡该管。
4. 在室温下以 100 × g 离心 8 分钟，使细胞沉淀。用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤细胞沉淀，并将细胞与新鲜或解冻的 HSPCs（比例为 10:1）在 PBS 中混合，最终体积为 80 µL/只小鼠。

3. 动物处理、筛选、基因分型及人HSPC与肝细胞移植的治疗

1. 动物操作
   1. 由于存在严重的免疫缺陷，TK-NOG 小鼠的繁殖、饲养和操作均需在无菌条件下进行。
   2. 始终穿戴实验服、手套、鞋套和口罩，以防止可能致病的微生物感染。
   3. 手术过程中使用无菌手套和器械，并全程以无菌方式操作动物。
2. 为实验选择 TK-NOG 小鼠
   1. 通过将雌性 TK-NOG 小鼠与非 TK-NOG 的雄性同窝仔鼠交配来维持 TK-NOG 品系群体，并通过基因分型筛选转基因后代。
      注意：在断奶时（通常为出生后 3–4 周）对雄性和雌性仔鼠进行基因分型（见步骤 3.3），以确定其是否携带转基因。
   2. 选择 6–8 周龄的雄性小鼠用于移植，因其对更昔洛韦（GCV）介导的表达 HSV-TK 转基因的肝细胞清除作用高度敏感。
   3. 在断奶或手术时为小鼠佩戴耳标以便识别，并记录动物的体重和健康状况。
3. 采用定量实时聚合酶链式反应检测 HSV-TK 转基因的存在
   1. 在断奶时（通常为 3–4 周龄）进行基因分型。为保持无菌，应在超净台中剪取小鼠耳部组织，并使用基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。
   2. 将从耳组织提取的基因组 DNA 在 20 µL 反应体系中扩增，用于检测由人白蛋白启动子调控的 HSV-TK 转基因：加入 1 µL 正向引物 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3'、1 µL 反向引物 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3'、0.5 µL FAM 探针 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3' 以及 10 µL 预混液，在实时定量 PCR 仪上进行扩增。
   3. 设定实时 PCR 程序如下：60 °C 预读 30 秒，95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 1 分钟），最后 60 °C 后读 30 秒。
      注意：若循环阈值（Ct）低于 22，则判定为 HSV-TK 转基因阳性。
4. 使用更昔洛韦和白消安的处理
   1. 使用 27 G 针头，在手术前第 7 天和第 5 天，每天两次经腹腔注射 GCV（6 mg/kg），每次体积为 100 µL 生理盐水，以清除小鼠体内表达 HSV-TK 转基因的实质细胞（如 图 2 所示的实验策略）。
   2. 在手术前第 3、2、1 天，使用 27 G 针头，每天一次经腹腔注射非清髓剂量的白消安（treosulfan，1.5 g/kg/天），每次体积为 100 µL 生理盐水。
   3. 手术前一天，使用 5 mm 采血针刺破下颌静脉，采集 2–3 滴血液（约 100 µL），经离心（4 °C 下 1,500 × g 离心 10 分钟）分离血清，用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测，以评估肝脏损伤程度。
5. 手术准备
   1. 手术前使用电推剪剃除小鼠腹壁左侧切口部位周围的毛发。
   2. 使用小动物麻醉机，在诱导舱中调节氧气流速为 1 L/min，异氟烷流速为 3%–5%。每次将一只小鼠放入诱导舱中进行麻醉诱导。
   3. 将一根无菌延长管（容积可容纳 550 µL 悬液；具体规格见 材料表）一端连接 30 G 针头，另一端连接 1 mL 注射器。
   4. 用注射器吸取混合的 HEPs 和 HSPCs 悬液（每只小鼠 80 µL，见第 2 节），将注射器安装至重复加样器的卡槽中，并调节加样器每次按压释放 10 µL。
   5. 待小鼠麻醉成功（通常需 3–4 分钟）后，将异氟烷气流切换至鼻罩，并将异氟烷浓度降至 2%–3%。
6. 小鼠脾内移植人 HSPCs 和肝细胞
   1. 所有手术操作均需在超净台内无菌条件下进行。
   2. 在操作台面铺上无菌巾，手术前先用 10% 聚维酮碘，再用 70% 异丙醇对小鼠左侧体表进行消毒。
   3. 使用 Vanna 型剪刀在腹壁左侧剪开皮肤、肌肉和腹膜，切口长约 1–1.5 cm，深约 5 mm，切口位置位于肋弓下缘下方约 5 mm 处，以进入腹腔。
   4. 找到脾脏，用镊子轻轻将其拉出至手术视野，便于操作，随后将 30 G 针头插入脾脏下极。
   5. 松开加样器的推杆，每次按压释放 10 µL 悬液，每只脾脏注射总量控制在 60–80 µL。缓慢拔出针头，并使用结扎器配合结扎夹夹闭脾脏。
   6. 用无菌 PBS 润湿的棉签将脾脏推回腹腔。
   7. 使用可吸收缝线以间断缝合法关闭腹壁肌肉层；皮肤缝合采用不可吸收缝线进行间断缝合。

结果

图1：从脐带血中富集CD34⁺细胞的示意图。（A）将脐带血叠加在淋巴细胞分离液（LSM）上，经离心以分离血沉棕黄层。（B）将LS柱置于磁力架上，并用BSA缓冲液冲洗，随后加入血沉棕黄层。表达CD34的细胞被截留在柱中，而CD34阴性细胞则被洗脱至不同的收集管中。最后，用推杆将滞留在柱内树脂中的CD34⁺细胞推出，并收集至新的离心管中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
27G1/2" 针头	BD biosciences	305109
30G1/2" 针头	BD biosciences	305106
5 mL 聚苯乙烯圆底试管 12 x 75 mm 规格	Corning	352054
BD 1 mL 无针结核菌素注射器	BD biosciences	309659
BD FACS array 生物分析仪	BD Biosciences		用于检测洗脱的 CD34+ 细胞纯度
BD FACS array 软件	BD Biosciences		用于分析 FACS array 获取的 CD34+ 细胞数据
BD FACS 裂解液	BD Biosciences	349202	用于裂解红细胞
BD LSR II	BD Biosciences		用于流式细胞术样本采集的仪器
BD Vacutainer 塑料采血管	BD biosciences	BD 367874	用于采集脐带血
牛血清白蛋白	Sigma-aldrich	A9576
CD34 微珠试剂盒，人源	Miltenyi Biotec	130-046-702	用于分离 CD34+ HSPC
CD34-PE，人源	Miltenyi Biotec	130-081-002	用于检测洗脱 CD34+ 细胞纯度的抗体
细胞计数载玻片	Bio-rad	1450015
ChargeSwitch gDNA Mini 组织试剂盒	Thermofisher scientific	CS11204	用于从耳组织提取基因组 DNA
棉签	McKesson	24-106-2S
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
延长管 Microbore 带固定公鲁尔锁滑夹。长度：60 英寸（152 厘米），容积：0.55 mL，无菌流路	BD biosciences	30914	连接至分液移液器，用于加载 HSPC 和 HEP 悬液
FACS Diva 版本 6	BD Biosciences		样本采集所需的流式细胞仪软件
胎牛血清（FBS）	Gibco	10438026
FLOWJO 分析软件 v10.2	FLOWJO, LLC		流式细胞术分析软件
更昔洛韦	APP Pharmaceuticals, Inc.	315110	处方药物
Greiner MiniCollect EDTA 试管	Greiner bio-one	450475
肝细胞解冻培养基	Triangle Research Labs	MCHT50
Horizon 开放式结扎夹施放器	Teleflex	537061	用于固定结扎夹
人肝细胞	Triangle Research Labs	HUCP1	冷冻保存的人肝细胞，经诱导验证
直型虹膜剪刀	Ted Pella, Inc.	13295
采血针	MEDIpoint	Goldenrod 5 mm
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于捕获 CD34+ 微珠（阳性筛选）
淋巴细胞分离液（LSM）	MP Biomedicals	50494	用于从外周血中分离淋巴细胞
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	用于固定 Quadro MACS 分离器和 LS 柱
McPherson-Vannas 微型解剖弹簧剪刀	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5605	用于在皮肤上做切口以暴露脾脏
微型解剖镊	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5157	用于夹持并拉出腹腔内的脾脏
小鼠 CD45-FITC	BD Biosciences	553080	小鼠特异性
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Hyclone	SH30256.02
Quadro MACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	可容纳四个 LS 柱
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875093
StepOne Plus 实时 PCR 仪	Applied Biosystems		用于基因分型的仪器
Stepper 系列重复分液移液器 1 mL	DYMAX CORP	T15469	用于以可控方式分注 HSPC 和 HEP 悬液
TaqMan 基因表达预混液	Thermofisher scientific	4369016
TC20 自动细胞计数仪	Bio-rad	1450102
TK-NOG 小鼠			由日本中央实验动物研究所（CIEA，日本；伊藤守博士和末光宏博士）提供
白消安类似物（Treosulfan）	Medac GmbH		由 Joachim Baumgart 博士（medac GmbH）提供
台盼蓝	Bio-rad	1450022
Vannas 型微型直剪刀，80 mm 长	Ted Pella, Inc.	1346	用于在皮肤上做切口以暴露脾脏
Weck 传统钛结扎夹	Esutures	523700	用于注射后结扎脾脏