开发具有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

Abstract

来源:Dagur， R. S. et al.， 建立用于 HIV 相关肝脏发病机制的双重人源化 TK-NOG 小鼠模型。J. Vis. Exp.（2019 年）

该视频演示了一种生成具有人类免疫系统和肝细胞的双重人源化小鼠模型的方法。它涉及通过脾内注射将人肝细胞和造血干细胞和祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内，导致肝细胞植入和人免疫细胞的发育。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 脐带血的加工和人造血干细胞/祖细胞 （HSPC） 的分离

1. 在层流柜中的无菌条件下执行协议的所有步骤。
2. 取收集在肝素化管中的脐带血 （CB），并通过添加磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 使体积达到 35 mL。如图 1 所示，将样品分层在淋巴细胞分离培养基 （LSM） 的顶部，并在 4 °C 下将带有分层 CB 的 LSM 以 400 x g 离心 35 分钟，无制动器><。 注意:小心轻柔地稀释血液，以避免在界面处混合。
3. 小心地去除顶部 LSM 和血浆层，并使用移液管将白色血沉棕黄层界面转移到新管中。
将
4. 血沉棕黄层重悬于 30 - 40 mL 冰冷缓冲液（PBS + 0.5% 牛血清白蛋白 [BSA] + 2 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]）中。使用移液管，将 20 μL 细胞悬液与 20 μL 0.4% 台盼蓝混合，将 10 μL 混合物移液到计数玻片的两个腔室中任一个腔室的外开口中，然后将玻片插入自动细胞计数器中以计数细胞><。 注意: 在所有步骤中使用冰冷的缓冲液，因为它有助于保持细胞活力。
5. 将细胞在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，并小心吸出上清液。然后，加入 300 μL 冰冷的缓冲液。
6. 添加 100 μL 人 Fc 受体阻断试剂和 100 μL 单克隆小鼠抗人 CD34 抗体偶联微珠，最多可添加 1 x 10⁸ 个细胞（参见材料表）。在 4 °C 下孵育 30 分钟，加入 10 mL 冰冷的缓冲液洗涤细胞，然后在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟><。 注意:如果存在超过 1 x 10⁸ 个细胞，则根据细胞数量进行放大。
7. 小心去除上清液，将沉淀重悬于 500 μL 缓冲液中，然后进行磁性分离步骤以富集 HSPC。
8. 将阳性选择 LS 色谱柱（参见材料表）置于磁激活细胞分选场中，并加入 3 mL 缓冲液。
9. 将样品加载到 LS 柱中，LS 柱可以将与人 CD34+ 结合的微珠捕获在样品中，并使其在重力作用入收集管。
10. 用缓冲液洗涤柱 3 次，并将洗脱液收集在 CD34 ^- 细胞组分的同一收集管中。
11. 用 5 mL 缓冲液浸入色谱柱中，将 CD34 ⁺ 细胞洗脱到新的收集管中。重复该过程以达到 >90% 的纯度。
12. 在血细胞计数器中使用台盼蓝染料对洗脱的 CD34 ⁺ 细胞进行计数。计数后，将 CD34 ⁺ 细胞以 300 x g 离心 5 分钟，并弃去上清液。
将
13. CD34 ⁺ 细胞重悬于 25 μL PBS 中注射以立即用于移植，或在冷冻培养基（罗斯威尔公园纪念研究所培养基 [RPMI 1640 培养基] + 50% 胎牛血清 （FBS） + 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）中以 1-200 万/mL 的浓度冷冻保存细胞，以进一步用于移植。
    注意: 在将活细胞用于移植之前，请务必重新计算活细胞。
14. 为了检查 CD34 ⁺ 洗脱液的纯度，取 50 μL 悬浮液，与 10 μL 藻红蛋白或 PE 偶联的抗人 CD34 抗体在 4 °C 下孵育 30 分钟。抗体孵育后，用 PBS 洗涤染色的细胞，将它们重悬于 100 μL PBS 中，然后继续进行流式细胞术。添加一管额外的无抗体细胞，以设计流式细胞仪中的门。
15. 采集后，通过在前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 图上选择感兴趣区域来分析数据，然后在 FSC 面积和 FSC 高度图上对单个细胞进行门控。在 PE 通道和 SSC 面积图中，对单个细胞上的 CD34 阳性细胞进行门控。

2. 用于移植的人肝细胞 （HEP） 的制备

1. 从液氮中取出冷冻保存的肝细胞，将小瓶快速浸入水浴中，解冻约 90 - 120 秒。
2. 取下样品瓶盖，将解冻的肝细胞倒入 50 mL 加热解冻培养基的锥形管中。
3. 用手摇动 50 mL 试管几秒钟，悬浮细胞。
   注意: 不要涡旋管子。
4. 在室温下以 100 x g 的离心沉淀细胞 8 分钟。在含有 0.1% BSA 的 PBS 中洗涤沉淀的细胞，并将它们与新鲜或解冻的 HSPC（比例 10:1）在 PBS 中混合，最终体积为 80 μL/小鼠。

3. 人类 HSPC 和肝细胞移植的动物处理、筛选、基因分型和治疗

1. 动物处理
   1. 由于严重的免疫缺陷，在无菌条件下繁殖、饲养和处理 TK-NOG 小鼠。
   2. 始终穿着实验服、手套、鞋套和口罩，以防止感染潜在的病原微生物。
   3. 使用无菌手套和器械进行手术，并在整个手术过程中无菌处理动物。
2. 选择用于实验的 TK-NOG 小鼠
   1. 通过与雄性非 TK-NOG 同窝小鼠繁殖雌性 TK-NOG 小鼠来维持 TK-NOG 菌株集落，并通过基因分型选择转基因后代。
      注意: 进行基因分型（参见步骤 3.3）以确定断奶时新生雄性和雌性小鼠中是否存在转基因。
   2. 选择 6 - 8 周龄的雄性进行移植，因为它们对 GCV 介导的表达 HSV-TK 转基因的肝细胞耗竭高度敏感。
   3. 在脱机或手术时给小鼠贴耳标，以方便识别。记下动物的体重和健康状况。
3. 使用定量实时聚合酶链反应对 HSV-TK 转基因的存在进行基因分型
   1. 在断奶时（通常在 3 - 4 周龄）进行基因分型。对于基因分型，在层流生物安全柜中切下一块小鼠耳朵以保持无菌，并使用基因组 DNA 分离试剂盒提取基因组 DNA。
   通过
   2. 添加 1 μL 正向引物 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3'、1 μL 反向引物 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3'、0.5 μL FAM 探针 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3'，在 20 μL 反应混合物中扩增从耳片中提取的基因组 DNA，以筛选人白蛋白启动子控制下的 HSV-TK 转基因， 以及 10 μL 预混液，在实时聚合酶链反应 （PCR） 仪器上。
   3. 按如下方式设置实时 PCR 设置:60 °C 30 秒（预读阶段），95 °C 10 分钟（保持阶段），95 °C 15 秒和 60 °C 1 分钟（PCR 阶段）的 40 个循环，以及 60 °C 30 秒（读后阶段）。
      注意: 阈值 （Ct） 低于 22 的周期被认为是 HSV-TK 转基因阳性。
4. 使用更昔洛韦和曲硫安进行治疗
   1. 使用 27 G 针头，在第 7 天和第 5 天每天 2 次向 TK-NOG 小鼠注射腹膜内 GCV 注射液 （6 mg/kg），在手术前每天 100 μL 盐水中注射，以消耗小鼠的转基因薄壁细胞（如图 2 中的实验策略所示）。
   2. 在手术前第 3 天、第 2 天和第 1 天，使用 27 G 针头在 100 μL 盐水中用非清髓性腹膜内剂量的曲硫丹（1.5 g/kg/天）对小鼠进行预处理。
   3. 手术前一天，用 5 mm 柳叶刀刺破下颌下静脉吸取 2 至 3 滴 （~100 μL） 血液，并通过离心（1,500 x g 在 4 °C 下 10 分钟）分离血清用于丙氨酸氨基转移酶 （ALT） 测定以评估肝损伤程度。
5. 手术准备
   1. 手术前用剪刀剃掉切口部位（腹膜壁左侧）周围的小鼠皮毛。
   2. 使用小鼠麻醉机在感应室中将氧气流量调节至 1 L/min，将异氟醚流量调节至 3% - 5%。一次将一只小鼠放入诱导室进行麻醉。
   3. 将无菌延长管（可容纳 550 μL 悬浮液;规格见材料表）的一端连接到 30 G 针头，另一端连接到 1 mL 注射器。
   4. 用混合的 HEP 和 HSPC 的悬浮液（80 μL/小鼠）填充注射器（参见第 2 节），将注射器安装在重复分配移液管的槽口中，并调整分配器以在每次按压中分配 10 μL。
   5. 一旦小鼠被麻醉（通常在 3 - 4 分钟后），将异氟醚流切换到鼻锥并将异氟醚流速降低至 2% - 3%。
6. 小鼠人 HSPC 和肝细胞的脾内移植
   1. 在无菌条件下，在层流柜中执行所有手术步骤。
   2. 在工作表面上放置干净的无菌窗帘，然后用 10% 聚维酮碘擦洗每只小鼠的身体左侧，然后用 70% 异丙醇擦洗，然后再做切口。
   3. 用 Vanna 型剪刀在腹膜壁左侧的皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口（~1 - 1.5 厘米长，5 毫米深），进入胸腔下缘下方约 5 毫米的腹膜腔。
   4. 找到脾脏，用镊子轻轻拉至手术区域，方便进入，将 30 G 针头插入脾脏下极。
   5. 解锁分液管的柱塞，一次分配 10 μL 体积，每个脾脏的限量为 60-80 μL。慢慢缩回针头，并使用结扎涂抹器用结扎夹夹住脾脏。
   6. 用用无菌 PBS 润湿的棉签涂抹器将脾脏推回体腔。
   7. 使用可吸收缝合间断缝合模式（非连续）闭合腹壁的肌肉层。使用不可吸收缝合线通过间断缝合模式完成皮肤闭合。

Results

图 1:从脐带血中富集 CD34 ⁺ 细胞的示意图。（A） 将脐带血分层在淋巴细胞分离培养基 （LSM） 上并离心以分离血沉棕黄层。（B） 将 LS 色谱柱置于磁力架上，用 BSA 缓冲液冲洗，然后加入血沉棕黄层。CD34 阳性细胞被困在柱中，CD34 细胞在单独的试管中洗脱。用柱塞将柱填料中捕获的 CD34 ⁺ 细胞浸入，并将细胞收集到新试管中。

图 2:人源化肝脏和免疫系统小鼠双重重建，然后 HIV-1 感染的实验设计示意...

Materials