来源：Davidson, H. W., 等. 在自身免疫性糖尿病模型中高效生成用于功能检测的抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频演示了一种通过逆转录病毒转导生成抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将活化的小鼠CD8+ T细胞加入涂有重组纤连蛋白片段的微孔板中。随后加入含有编码抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）的转基因RNA的逆转录病毒载体，并对微孔板进行离心以促进转导。经过孵育后，转导的细胞在其表面表达抗原特异性的CAR。
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方法文章
一种生成抗原特异性CAR T细胞的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 单链Fab抗体（scFab）-CAR的构建与验证。
注意：CAR 通常包含三个关键结构域——抗原靶向结构域、间隔区/跨膜结构域以及胞内信号转导结构域。每种 CAR 的具体设计取决于其预期靶标，因此除与逆转录病毒生成相关的构建体关键特征外，本方案中不会详细描述这些设计。下述研究所用 CAR 的整体设计如图1所示。简而言之，靶向结构域由亲本单克隆抗体的完整轻链以及重链的可变区和 CH1 结构域组成，二者通过一个半刚性连接肽相连；间隔区/跨膜结构域来源于小鼠 CD28；信号转导结构域则融合了来自小鼠 CD28、CD137（4-1BB）和 CD247（CD3ζ）的元件。这些元件可通过标准分子生物学方法（如拼接重叠聚合酶链式反应（PCR））或合成相应的“基因片段”进行组装。mAB287 CAR 构建的详细信息见 Zhang 等人的研究。cDNA 序列可应要求向作者索取。
- 组装CAR结构
- 分别合成靶向单链Fab抗体（scFab）以及组合的间隔区/信号域，使用“三点”连接技术组装最终结构（图1）。
注意：CAR插入片段的关键要求是其应包含侧翼限制性内切酶位点，以便连接至逆转录病毒表达载体pMSCV-IRES-GFP II（pMIG II），或使用相关衍生载体亦可。
- 分别合成靶向单链Fab抗体（scFab）以及组合的间隔区/信号域，使用“三点”连接技术组装最终结构（图1）。
- 验证CAR表面表达
- 使用通过标准方案（例如Holst等）生成的pMIG II来源的逆转录病毒颗粒转导杂交瘤细胞。
- 进行流式细胞术分析，检测CAR载体中GFP的表达。
- 使用针对小鼠κ链的标记抗体（例如克隆RMK-45）染色检测转导后杂交瘤细胞表面CAR的表达。
- 验证CAR特异性
- 用适当的包被平板抗原或细胞抗原刺激转导后的杂交瘤细胞。共培养过夜后，收集上清液及分泌的细胞因子，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测。
注意：理想情况下，每个CAR在用于转导前应独立验证。在此步骤中，实验可暂停并在之后重新启动。
- 用适当的包被平板抗原或细胞抗原刺激转导后的杂交瘤细胞。共培养过夜后，收集上清液及分泌的细胞因子，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测。
2. 病毒生产细胞的转染（第 -4 天至第 3 天）
注意：使用 Phoenix-ECO 细胞生产逆转录病毒（参见材料表）。在产生潜在感染性因子时，应采取适当的预防措施（最好包括指定的生物安全二级（BSL-2）生物安全柜，以及用于培养转染/转导细胞的独立培养箱）。
- 解冻Phoenix细胞（第-4天）
- 解冻2 × 106个Phoenix-Eco细胞。若计划进行多次转导，需按比例增加Phoenix细胞数量。
- 将细胞接种于含10 mL培养基（含10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））的10 cm组织培养皿中。
- 传代Phoenix细胞（第-3天）
- 移除培养基，并用5 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。
- 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C、10% CO2条件下孵育3分钟。
- 收集细胞，200 × g离心3分钟形成细胞沉淀。用10 mL新鲜培养基重悬细胞并重新接种，于37 °C孵育。
- Phoenix细胞辐照（第-1天下午）
- 为最大限度抑制细胞进一步分裂，按步骤2.2所述方法收集Phoenix细胞，重悬于5 mL培养基中，置于冰上进行γ射线辐照（1000 rad）。
注意：进行放射性操作时应谨慎，避免人员暴露。 - 将辐照后的细胞离心，重悬于新鲜培养基中，以每孔每种CAR 2 × 106个细胞（溶于10 mL培养基）的密度接种，并继续孵育。
- 为最大限度抑制细胞进一步分裂，按步骤2.2所述方法收集Phoenix细胞，重悬于5 mL培养基中，置于冰上进行γ射线辐照（1000 rad）。
- 转染（第0天上午）
- 吸除Phoenix细胞的上清液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后沿培养皿壁缓慢滴加7 mL低血清培养基（如Opti-MEM），避免扰动单层细胞。将细胞放回培养箱。
- 取两个14 mL圆底聚丙烯管，每管加入1.5 mL低血清培养基。向其中一管加入40 µL转染试剂（见材料表）。
- 向另一管加入15 µg Ab-CAR质粒（由步骤1制备）和5 µg包膜与包装质粒（5 µg pCL-Eco）。室温孵育5分钟。
- 将步骤2.4.2中的转染试剂混合物沿管壁滴加至第二管中，避免接触管壁，然后轻轻吹打3次混匀。室温孵育至少20分钟。
- 将3 mL混合液逐滴加入Phoenix细胞中，放入组织培养箱。
- 4–5小时后加入1 mL FCS。于37 °C继续培养过夜。
- 更换培养基（第1天）
- 移除含有质粒/转染试剂复合物的上清液，并按照机构关于感染性材料处理的规程进行处置。向细胞中加入4 mL新鲜预热的培养基。
- 收集病毒用于转导（第2天）
- 用无菌注射器收集Phoenix细胞的含病毒培养基，经0.45 µm滤膜过滤以去除残留细胞碎片，收集至新管中。
- 加入重组人白细胞介素-2（rhIL-2）储备液，使其终浓度为200国际单位（IU）/mL。立即用于转导（步骤5.3）。向Phoenix细胞中加入4 mL新鲜培养基，并放回培养箱。
- 重复收集病毒（第3天）
- 重复步骤2.6，但将Phoenix细胞作为感染性废弃物丢弃，不再添加新鲜培养基。此上清液用于步骤5.4。
3. 初始CD8 T细胞的分离与激活（第-1天至第0天）
注意：此前，在4–5周龄时从雌性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠中收集CD8 T细胞，此时间点处于胰岛炎症启动之前。所有小鼠操作均应遵循机构动物护理 & 使用委员会（IACUC）批准的实验方案。使用商用阴性选择试剂盒从脾细胞中富集CD8 T细胞。
- 用 CD3/CD28 抗体包被培养板（第 -1 天）
- 向 24 孔板的每个孔中加入 1 mL 抗小鼠 CD3 和 CD28 抗体混合液（两种抗体在 PBS 中浓度均为 1 µg/mL），4 °C 过夜孵育。
- 次日，在加入小鼠 CD8 T 细胞前（步骤 4.1），用 1 mL 无菌 PBS 洗涤培养板 3 次。
注意：需包被的孔数因实验而异，取决于所需活化 CD8 T 细胞的总数。
- 脾细胞的收集（第 0 天）
- 使用 CO2 吸入法处死两只 4–5 周龄的 NOD 雌性小鼠，随后进行断头。取出脾脏，并将其置于冰上含 10 mL PBS 的细胞培养皿中的细胞筛网上。
- 在细胞培养超净台中，将每个脾脏切成 3–5 块，用 3 或 5 mL 注射器的无菌活塞头按压组织，使脾组织分散，细胞通过金属网筛滤出。
- 通过将脾细胞重悬于 1:4 稀释的红细胞裂解缓冲液（每只脾脏使用 1 mL 裂解缓冲液与 3 mL PBS 混合）中，轻柔去除红细胞，并在室温下孵育 5 分钟。
- 然后，取 10 μL 细胞悬液与台盼蓝染液混合，使用血细胞计数板进行细胞计数，其余细胞以 350 x g 离心 7 分钟收集细胞沉淀。
- CD8 T 细胞的富集（第 0 天）
- 使用小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒，按照制造商说明书通过阴性选择法富集 CD8 T 细胞。
注意：为确保高纯度，在计算需加入的生物素化抗体体积时，应始终向上取整细胞数量（例如，当细胞数为 9.1 x 107 时，使用适用于 108 细胞的试剂体积）。 - 每 1 x 108 个细胞，将细胞沉淀重悬于 400 µL 缓冲液和 100 µL 生物素化抗体混合液中，充分混匀后于冰箱（4 °C）孵育 5 分钟，以允许抗体结合。
- 每 1 x 108 个细胞，加入 300 µL 标记缓冲液和 200 µL 抗生物素磁珠，充分混匀后于 4 °C 孵育 10 分钟。
- 在等待磁珠结合期间，将分离柱安装至磁性分离器上。用 3 mL 标记缓冲液冲洗柱子进行洗涤。
- 在将磁珠/细胞混合物加载到分离柱前，先通过 40 µm 细胞筛网过滤 1000 µL 混合液，以去除细胞聚集体。将柱子的穿流液收集至预冷的 15 mL 离心管中。
- 按照制造商说明洗涤柱子，将所有流出液收集至同一管中。测定细胞数量（方法同步骤 3.2.4），以 350 x g 离心 5 分钟收集细胞。用 2 mL 完全 T 细胞培养基（含 FCS、2-巯基乙醇、rhIL-2（200 U/mL）、小鼠白细胞介素-7（mIL-7，0.5 ng/mL）、ITS、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基）重悬细胞，350 x g 离心 5 分钟进行洗涤。
- 将细胞重悬于预热至 37 °C 的完全 T 细胞培养基中，细胞浓度为 0.25–0.5 x 106/mL。
- 使用小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒，按照制造商说明书通过阴性选择法富集 CD8 T 细胞。
4. T细胞激活（第0至2天）
- 将2 mL细胞悬液（0.25–0.5 × 106/mL）加入步骤3.1.2中包被有CD3/CD28抗体的24孔板的每个包被孔中。采用旋转方式加入细胞，使其均匀分布。
注意：加入细胞时应采用旋转方式，以确保细胞均匀分布并减少边缘效应。若细胞在孔边缘聚集，则转导效率和细胞存活率均会降低。 - 作为对照，将相同数量的CD8 T细胞接种至同一块板中的一个未包被孔中。将细胞置于37 °C、含10% CO2的培养箱中孵育48小时。
注意：孵育48小时后，可通过显微镜确认细胞激活情况；被激活的细胞体积会大于未接触抗CD3/CD28抗体的细胞。
5. 活化CD8 T细胞的转导（第1至3天）
注意：本方案采用旋转转导法。需要配备摆动转子和组织培养板适配器、且能够维持内部温度为 37 °C 的离心机。为确保最高转导效率，在转导当天，收集病毒前应先将离心机预热至 37 °C。
- 人纤维连接蛋白片段包被板的制备（第1天至第2天）
- 在第1天，向24孔板的各孔中加入0.5 mL纤维连接蛋白溶液（50 µg/mL，溶于PBS），于4 °C孵育过夜。
注意：通常每板转染的Phoenix细胞需要两个纤维连接蛋白包被的孔。 - 在第2天，移除纤维连接蛋白溶液，并加入1 mL含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液。室温孵育30分钟，以“封闭”非特异性结合位点。
- 用1 mL无菌PBS洗涤处理过的孔。移除洗涤液后，板即可使用；或可密封后于4 °C保存最多一周。
- 在第1天，向24孔板的各孔中加入0.5 mL纤维连接蛋白溶液（50 µg/mL，溶于PBS），于4 °C孵育过夜。
- 活化CD8 T细胞的收集（第2天）
- 收集活化的CD8 T细胞，使用台盼蓝染色或合适的自动化仪器计数并计算细胞活力。
- 通过离心收集细胞，并重悬于转导用培养基中，浓度为5 x 106个活细胞/mL。在CO2培养箱中，用完全T细胞培养基继续培养少量细胞，作为后续转导细胞荧光激活细胞分选（步骤6）的对照。
注意：激活48小时后，细胞总数应增加约1.5倍，且细胞活力应高于95%。
- 转导（第2天）
- 将100 µL活化CD8 T细胞悬液（含0.5 x 106个细胞）加入纤维连接蛋白包被板的各孔中。然后向每孔加入1.5–2 mL含病毒的培养基（来自步骤2.6）。轻轻旋转混匀，使细胞均匀分布（图2）。
- 将板放入密封塑料袋中并封口（提供二次防护）。于37 °C以2000 x g离心90分钟。
- 从离心机中取出板，在生物安全柜中小心移除塑料袋，并确保板外表面未被培养基污染。
- 随后将板转移至专用的37 °C CO2培养箱。4小时后，从每孔中移除1 mL培养基，并替换为1 mL预热的完全T细胞培养基。将板放回CO2培养箱。
注意：所有来自转导细胞的培养基均应作为感染性废弃物处理。
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结果
图1：CAR逆转录病毒构建体的示意图。 CAR由来源于合适的小鼠单克隆抗体Fab片段的靶向结构域，以及来源于小鼠CD28、CD137和CD247的间隔区/跨膜锚定区/信号传导结构域组成。合成的cDNA被插入pMIG-II逆转录病毒表达载体中。用于构建mAb287-CAR的限制性内切酶位点如图所示。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 (50 mM) | Gibco | 21985-023 | 50 µM |
| 5' RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| 抗小鼠 CD28 抗体 | eBioscience | 14-0281-86 | 终浓度为 1 µg/ml |
| 抗小鼠 CD3e 抗体 | eBioscience | 145-2C11 | 终浓度为 1 µg/ml |
| 生物素标记大鼠抗小鼠 IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | 工作浓度为 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| 无内毒素大提纯试剂盒（Endo-free Maxi-Prep kit） | Qiagen | 12362 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | 终浓度 50 µg/ml |
| 热灭活胎牛血清（FCS） | Hyclone | SH30087.03 | 终浓度 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS 100x） | ThermoFisher | 51500056 | 终浓度为 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS 分离缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| 小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒 | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| 小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM 培养基 | ThermoFisher | 31985070 | |
| 青霉素-链霉素（5000 U/ml） | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO 细胞 | ATCC | CRL-3214 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | 工作浓度为 50 µg/ml（溶于 PBS） |
| rhIL-2（储存浓度 105 IU/µl） | Peprotech | 200-02 | 终浓度为 200 IU/ml |
| rmIL-7（储存浓度 50 ng/µl） | R&D | 407-ML-005 | 终浓度为 0.5 ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| 无菌细胞筛 | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
